四电极系统下辅酶Q10在氧化锌纳米棒修饰电极上的光电检测

    罗贵铃 牛燕燕 邵波 张晓萍 赵常志 孙伟

    

    

    

    摘?要?采用电沉积法制备了ZnO纳米棒修饰氧化铟锡（ITO）电极（ZnONR/ITO），利用四电极系统建立了一种高灵敏检测辅酶Q10（UQ10）的光电化学分析新方法。利用玻碳电极为第二工作电极，将溶液中UQ10预还原为UQ10H2，可作为电子供体在ZnONR/ITO上发生氧化反应，电子跃迁至导带后，光电流降低，进而用于检测UQ10。对电沉积ZnO纳米棒和光电化学检测条件进行了优化，在最优测定条件下，UQ10浓度的对数与光电流成反比，线性检测范围为1.0×1012～1.0×105 mol/L，检出限为3.3×1013 mol/L（S/N=3）。

    关键词?辅酶Q10; 光电化学分析; 四电极系统; 氧化锌纳米棒

    1?引 言

    光致电化学（PEC）分析通常是借助具有光电响应的纳米材料修饰电极，以具有氧化还原性质的小分子化合物（如抗坏血酸、多巴胺和过氧化氢）作为电子受体或电子供体，建立对被测物质敏感的PEC分析系统[1，2]，目前已广泛应用于蛋白质、免疫、DNA等生化分析领域[3～6]。例如，郑晨琰等[7]通过电沉积和水热法在氟掺杂SnO2导电玻璃（FTO）表面修饰纳米金（AuNPs）和三氧化钨（WO3），制备WO3/AuNPs/FTO，用于自来水和维生素B12中Co2+的检测。Zhu等[8]制备了三维CdS纳米片包裹的碳纤维骨架光电极，用于PEC免疫分析检测利钠肽的含量。Li等[9]利用AuNPs敏化的垂直排列的板状WO3修饰光电极，用于食用酒中乙醇含量的PEC检测。

    辅酶Q（Coenzyme Q）又称泛醌（Ubiquinone，UQ），广泛存在于生物膜中，是一类含不同长度聚异戊烯侧链的醌类化合物的总称[10]。根据UQ侧链异戊烯单位的数目不同，其命名也不同，人类和哺乳动物含有的是10个异戊烯单位的UQ，称为UQ10。人体中UQ10主要来源于生物合成以及饮食摄入，广泛分布在人体组织中，尤其是线粒体的内膜中，从而影响内膜的流动性和渗透性。在线粒体电子传输链和氧化磷酸化生成ATP的过程中，UQ10是必不可少的电子载体，具体作用机制为：UQ10可接受两个氢，并获得两个电子，生成还原型UQ10（UQ10H2），进而参与体内的各种氧化还原反应。UQ10H2还可将所含的一个氢原子传递给自由基，将自由基还原，自身被氧化为半还原态; 被氧化的UQ10再经过酶催化作用，恢复为还原态[11～13]。同时，UQ10在维持细胞氧化还原状态中起关键作用，具有抗氧化、抑制自由基的作用[14]。缺乏UQ10可能引起心力衰竭、高血压、神经退行性疾病和糖尿病等疾病，因此检测UQ10的含量至关重要。目前，测定UQ10的方法主要有高效液相色谱法和质谱法[15]等，这些方法能够有效地进行UQ10的定性和定量分析，但存在设备昂贵、灵敏度低、操作复杂、成本高等缺点，因此，亟需建立设备简单、灵敏度高的快速检测UQ10的方法。

    纳米ZnO的禁带宽度为3.37 eV，具有电荷传输快、制备成本低、光电性能好等优点，并能在生长高质量单晶衬底的同时进行同质外延，广泛应用于压电材料、气体传感和生物传感器等领域[16～20]。ZnO纳米材料的可控生长是实现其性能调控和实际应用的基础，已报道的ZnO纳米材料包括纳米棒[20]、纳米线[21]、纳米管阵列[22]和空心纳米球[23]等，其中，ZnO纳米棒（ZnONR）具有合成成本低、无毒、电子通路大、表面积大和电子传输率高等优良性能，已被用于构建PEC生物传感器[24～26]。Kang等[24]在还原石墨烯层（rGO）上直接合成ZnONR阵列，ZnO/rGO基光阳极用于谷胱甘肽的自供电PEC生物传感研究，检测线性范围为10～200 mmol/L，检出限为2.17 mmol/L，表现出良好的选择性、可重复性和稳定性。韩志钟等[26]在导电玻璃表面利用水相法制备ZnO纳米花-棒立体结构作为电极，固定探针基因制得ZnO纳米花-棒立体结构基PEC生物传感器，并用于无标记检测DNA。

    本研究以UQ10作为电子供体设计PEC反应系统，构建了一种基于四电极系统的PEC分析平台。四电极系统中，通过UQ10在第二工作电极（玻碳电极）表面预还原成UQ10H2，并作为第一工作电极（ZnONR/氧化铟锡导电玻璃，ZnONR/ITO）的电子供体而被氧化，电子跃迁至导带，从而降低了光电流信号，通过光电流的降低值与UQ10浓度的关系，实现对UQ10的定量分析。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    CHI 832B型双通道电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）; PEAC 200A型光电化学反应仪（天津艾达恒晟科技发展有限公司，激發光波长为365 nm）; 以ITO导电玻璃（8.0 mm×5.0 cm，深圳南玻集团伟光公司）为基底制备的ZnONR/ITO作为第一工作电极，Ag/AgCl电极（饱和KCl溶液）为参比电极，铂丝为对电极，玻碳电极（GCE，直径3.0 mm）为第二工作电极（还原电极），组成四电极工作系统; JSM-7100F扫描电子显微镜（SEM，日本电子株式会社）。

    Zn（NO3）2·6H2O、无水乙醇（EtOH）和UQ10（阿拉丁（上海）试剂有限公司）; LiClO4（成都化工试剂厂）; 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS）为支持电解质; 其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

    2.2?ZnONR/ITO的制备

    采用电沉积的方法制备ZnONR/ITO[27]。将ITO导电玻璃依次在丙酮、乙醇和超纯水中各超声清洗15 min，氮气吹干后，在一端留出约1.0 cm作为电极的端子，在另一端表面留出长度为5.0 mm的空白作为ITO电极的工作面，其它部分用绝缘胶带封住。采用三电极体系镀膜，电解液的组成为2.5～5.0 mmol/L Zn（NO3）2和0.1 mol/L KCl，以ITO导电玻璃为工作电极，Pt板为对电极，Pt丝为参比电极，恒温60℃，设置Pt板的电极电势为1.20～1.50 V，沉积时间设置为1500～5000 s，记录时间-电流曲线，电沉积完成后，用超纯水洗去表面吸附的杂质，干燥后即得到ZnONR/ITO。

    2.3?实验方法

    采用四电极双通道系统，ZnONR/ITO为第一工作电极，GCE为第二工作电极。将GCE的还原电位设定为0.35 V，ZnONR/ITO的偏压为0.1 V，以0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液为支持电解质。考察ZnONR/ITO的基线电流稳定性，GCE活化60 s后，以40 s为一个循环单位控制光电化学反应仪光闸的开/关，记录空白光电流曲线。然后向电解池中加入40 μL 1.0×103 mol/L UQ10溶液，电解液的总体积为4.0 mL。采用上述相同的方法，记录样品的电流-时间曲线，以样品和空白光电流的差值定量检测UQ10。

    3?結果与讨论

    3.1?四电极系统的测试原理和电解池的构造

    UQ10分子结构中存在共轭双键，具有良好的电化学活性。由于UQ10的氧化电位低于氧的还原电位[28]，在水溶液中，UQ10通常以氧化态存在，无法作为电子供体，在光激发的ZnONR/ITO上失去电子发生PEC反应。因此，必须借助于第二工作电极将UQ10还原，继而才能被光激发的ZnONR氧化而产生光电流。四电极系统示意图和四电极电解池如图1所示。在四电极工作模式下，两个工作电极的电位可分别设定，输出电流可分别观察记录。

    3.2?ZnONR/ITO的表征

    采用SEM对ZnONR/ITO的形貌进行表征。如图2所示，在最优电沉积条件下，制备的ZnONR呈六棱棒状，均匀地生长在ITO电极表面，纳米棒的六棱柱直径约320 nm。

    3.3?ZnO纳米棒电沉积条件

    考察了电沉积时间（t）、沉积电位（Edep）和Zn（NO3）2浓度（C）对制备ZnONR/ITO的光电流（Photocurrent）响应的影响，结果如图3所示。在电解液Zn（NO3）2溶液的初始浓度为3.5 mmol/L、电沉积电位为1.30 V和电沉积时间为3000 s条件下，制得ZnONR/ITO的光电响应最好。实验过程中发现，过长的沉积时间、过低的沉积电位或较高的Zn（NO3）2浓度，都会导致沉积层过厚，在长时间的光电测试过程中，会有明显的脱落现象，导致修饰电极ZnONR/ITO的稳定性降低; 而过短的沉积时间或过低的沉积温度，又会导致ITO表面沉积的ZnONR柱高过低，光电流响应极弱。

    3.4?UQ10的电化学行为

    采用GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为对电极的三电极系统，考察UQ10的电化学行为。由于UQ10水溶性较差，加入EtOH以改善UQ10的溶解度; LiClO4是水和非水溶液共用的支持电解质，选择LiClO4-EtOH-PBS作为电解液。取1.0×105 mol/L UQ10和1.0 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液于电解池中，记录循环伏安（CV）曲线，如图4A所示，通过CV图确定了UQ10还原电位区间。UQ10在GCE表面0.30 V开始发生还原，0.45 V完成还原反应。本研究引入GCE作为第二工作电极，进一步采用四电极系统考察还原电位（Ered，0.5～ 0.1 V）对光电流响应的影响，结果如图4B所示，可见在GCE上的最佳还原电位为0.35 V。

    3.5?ZnONR/ITO对UQ10的PEC响应

    采用计时电流法考察了ZnONR/ITO对UQ10的PEC响应，结果如图5所示。在0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS溶液中，ZnONR/ITO的光电流值为800 nA（图5曲线a）; 而在含2.0×105 mol/L UQ10的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS溶液中，ZnONR/ITO的光电流值为301 nA（图5曲线b），说明UQ10的存在减弱了ZnONR/ITO的PEC响应。随着实验的进行，GCE上的还原电流（图5曲线c）均比较稳定，说明GCE对UQ10有电化学响应，在0.35 V电位下，能够很好地将UQ10还原为UQ10H2。

    推测此反应的机理如图6所示，ZnONR受到光的激发后，外层电子从价带跃迁至导带，电子转移到半导体电极从而产生光电流（图6A）[29，30]; UQ10经过第二工作电极GCE还原后形成UQ10H2，电子转移到半导体电极的导带，从而降低了光电流（图6B）。通过测量光电反应的电信号的变化，对底物实现快速检测。

    3.6?UQ10光电响应条件优化

    UQ10的还原过程与电解液的pH值有关，进而会影响PEC响应。设置第一工作电极偏压为0.10 V，第二工作电极的还原电位为0.35 V，考察不同pH值（6.0～8.0）对光电响应的影响。采用计时电流法分别以不同pH值的含2.0×105 mol/L UQ10的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS和0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS为电解液，以光电流响应差值表征不同pH值对UQ10还原反应的影响（图7A），并进一步考察电解质中PBS体积（V）对UQ10光电响应的影响（图7B），当pH=6.5，PBS加入量为400 μL时，电解质体系中酸碱度适中，既能提供足够的质子参与反应，也能保持光电信号稳定。

    ZnONR是一种具有光电活性的无机纳米材料，其电子状态受电极电位的影响，考察偏压（Ebias）对光电响应的影响（图7C）。在0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS（含2×105 mol/L UQ10）混合液中，当偏压为0.1 V时，光电流响应最大。设置偏压为0.10 V，考察激发光强度对光电流响应的影响（图7D），在实验过程中，通过改变光程（s）调整光强度。随光程的增大，光电流强度显著增强，在7 cm（对应的光照强度为316 μW/cm2）时达到最大值; 随着光程继续增大，光电流逐渐减小，说明光强对光电响应有显著影响。这是由于过长的光程导致光照强度降低，从而使ZnONR受光照产生电子-空穴对的效率降低，光电流下降。

    3.7?ZnONR/ITO对UQ10的光电流响应

    在最优的实验条件下，分别测定ZnONR/ITO在不同浓度UQ10（C）的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液中的光电流响应（图8A），发现随着UQ10浓度增加，光电流逐渐减小。由图8B可知，光电流响应在1.0×107 mol/L UQ10时出现拐点后下降趋势渐缓。UQ10的浓度在1.0×1012～1.0×105 mol/L范围内，其浓度的对数与光电流呈良好的线性关系，线性回归方程为I（nA）=64.28 lg（C （mol/L））-230.0（R2=0.998），检出限為3.3×1013 mol/L（S/N=3）。与文献报道的检测UQ10方法（表1）相比，本方法的检出限低于色谱法和光学法。

    3.8?常见干扰物质对光电流的影响

    在最佳的实验条件下，考察了常见共存物质对UQ10光电流响应的影响，结果见表2。在2.0×106 mol/L UQ10的0.5 mol/L LiClO4-EtOH-PBS混合液中，当允许误差<5%时，等浓度的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和维生素K3（VK3）会明显干扰UQ10的测定; Fe3+、K+、Cl、Zn2+、NO3和丙氨酸不会干扰测定。这是由于FAD和VK3与UQ10的还原电位相近，还原后，电子跃迁到半导体的导带上，光电流响应增强，干扰UQ10的测定; 其它无机离子和氨基酸与UQ10的还原电位差距大，因此不会产生干扰。

    3.9?ZnONR/ITO光电极的重现性和稳定性

    连续8次测定同一浓度的UQ10后，GCE的还原电流无明显波动，表明第二工作电极GCE在还原UQ10时没有产生钝化。平行制备5支工作电极，测定相同浓度UQ10光电流响应的RSD<1.7%。ZnONR/ITO在干燥避光的环境下保存10天后，对同浓度的UQ10的光电流响应减小0.8%; 保存20天后，光电流的响应为初始光电流的81%。结果表明，ZnONR/ITO具有良好的稳定性，说明电化学沉积法在ITO电极表面制备ZnONR过程中具有独特优势，并且ZnONR/ITO对UQ10的定量分析具有良好的稳定性。

    3.10?实际样品分析

    将ZnONR/ITO用于辅酶Q10胶囊（上海衡山药业有限公司）的定量检测。取3粒辅酶Q10胶囊的内容物，混匀，称取250 mg内容物，在40 mL无水乙醇中超声处理10 min，然后将混合物离心分离，取上清液，用乙醇定容至100 mL。进一步取0.5 mL 样品溶液稀释并定容至10 mL，制得辅酶Q10胶囊样品液。取40 μL样品液，注入电解池（总体积为4.0 mL）中进行光电检测，采用标准加入法计算回收率，结果见表3，回收率在99.0%～104.5%之间。利用高效液相色谱法检测辅酶Q10胶囊样品中的UQ10含量[34]，与PEC检测结果相近。结果表明，此四电极系统光电传感器可用于辅酶Q10胶囊样品中UQ10的含量分析。

    4?结 论

    采用电沉积的方法，将具有光电活性的ZnONR修饰在ITO电极表面，成功制备了ZnONR/ITO，此修饰电极同时具有光敏性和电子受体的功能，可大大提高光电转换的效率。利用四电极双通道电化学系统，以第二工作电极GCE作为还原电极，在0.35 V的电位下，可将溶液中的UQ10还原为UQ10H2，基于此建立了高灵敏检测UQ10的新方法。本方法的检测范围为1.0×1012～1.0×105 mol/L，检出限为3.3×1013 mol/L。

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