原子力显微镜纳米压痕技术用于评估纳米药物功效

    付彦丰 杨钰 张清荣 蔡明军 徐海娇 杨国程 单玉萍

    

    

    

    摘?要?具有靶向性藥物递送和可控释放双重优势的纳米药物是抗肿瘤药物的研究热点。 在纳米药物应用中，药效评估是非常重要的方面。本研究利用基于原子力显微镜（AFM）的纳米压痕技术，通过分析纳米药物作用后细胞力学性质（杨氏模量和粘弹性等）的改变，评估其药效。结果表明，与游离的阿霉素（DOX）相比，DOX及喜树碱（CPT）脂质体纳米药物对宫颈癌（HeLa）细胞的药效作用更明显。进一步检测DOX和CPT不同摩尔比（4∶1和1∶4）混合的脂质体纳米药物对HeLa细胞的药效差异，发现在DOX和CPT的摩尔比为4∶1条件下，两种药物的协同作用增强了药效。对纳米药物作用后的HeLa细胞进行粘弹性评估，发现随着纳米药物作用时间的延长，细胞粘弹性随之降低。本研究提供了一种简单有效的筛选纳米药物的方法。

    关键词?原子力显微镜; 纳米压痕; 脂质体; 纳米药物功效; 细胞力学

    1?引 言

    随着纳米药物的发展，其在细胞内的靶向递送[1～3]、药物缓释[4～6]和改善药物相容性[7]等方面显示出明显的优势。纳米药物是以纳米材料作为载体的药物，具有颗粒小、比表面积大、活性位点多、吸附性强等特点，通过高效的药物递送可延长药物半衰期，并减少药物对正常细胞的影响。近十几年来，评估纳米药物功效与细胞凋亡之间的关系一直是研究热点[8]。目前，一些方法已用于纳米药物功效的检测，例如荧光素发光[9，10]、DNA凝胶电泳[11]和流式细胞术[12]。这些方法多通过测量药物治疗后细胞内生物大分子的变化，反映纳米药物的功效。Shen等[13]利用流式细胞仪检测小鼠成纤维细胞中活性氧含量的变化反映铁-MIL-101-NH2纳米药物对细胞凋亡的影响。纳米药物作用后，受细胞骨架和功能蛋白影响的细胞力学性质会发生很大变化[14，15]，但是需要在生理条件下实时检测细胞力学性质的变化，才能更真实和确切地反映真实细胞中的情况。

    已有研究者利用原子力显微镜（AFM）测量细胞膜的粗糙度，研究纳米药物功效[16，17]，而活体细胞膜成像的难度较大，一些细节变化难以检测。作为AFM重要应用的纳米压痕技术是测试材料力学性能最简单的方法之一，可实时检测活细胞的力学性质[18～20]。细胞在生长、分化、凋亡、癌变及与邻近细胞或细胞外基质相互作用时，细胞的内部结构和性质会产生明显的变化[21，22]。在多数情况下，由于细胞骨架结构和组织的改变，癌细胞（如膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌和卵巢癌[23-28]）比正常细胞具有更大的可变形性。实际上，细胞骨架密度的降低是肌动蛋白丝的部分缺失[29]或微管紊乱[30]的结果。基于AFM的纳米压痕技术可利用压电陶瓷控制灵敏的微悬臂接触细胞，在接触细胞膜后，保持垂直位置的恒定压力，通过记录AFM微悬臂的偏转，可检测到细胞骨架因药物作用而产生的细微的结构变化。细胞具有弹性，由微管和肌动蛋白支持，药物的作用可引起细胞凋亡，导致细胞骨架被破坏，从而降低细胞的杨氏模量。Zhang等[31]利用AFM纳米压痕技术检测了西妥昔单抗的抗癌效果。作为广谱抗癌药物，阿霉素（DOX）和喜树碱（CPT）可用于制备脂质体纳米药物[32，33]，其药效评估尤为重要。

    本研究通过分析不同浓度DOX和CPT脂质体纳米药物与细胞孵育不同时间后细胞的力学性能改变来评估纳米药物的功效。在不同条件下，经纳米药物处理后，测量了细胞的反馈力、压痕深度与杨氏模量; 同时，分析了与纳米药物共孵育不同时间后细胞的粘弹性，以评价纳米药物的功效。

    2?实验部分

    2.1?细胞培养

    宫颈癌（HeLa）细胞由中国科学院上海干细胞库提供。细胞在DMEM培养基（Dulbecco Modified Eagle Hyclone）中，于37℃，5% CO2气氛中培养。将10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素和BIOMYC-3（以色列Biological Industries）抗生素溶液加入细胞培养基中。将具有高硬度的22 mm × 22 mm石英玻璃盖玻片加入到35 mm细胞培养皿中，获得约70%的细胞生长密度后，进行纳米压痕实验。实验前，用1000 mL磷酸盐缓冲液（PBS，8.0 g NaCl、3.4785 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4溶于1000 mL蒸馏水）清洗3次，用无血清的DMEM培养液再润洗一次，之后在培养皿中加入2 mL无血清的MEM培养液，进行纳米压痕实验。

    2.2?压痕实验

    利用Agilent AFM 5500（美国Agilent Technologies公司）在37℃恒温加热台上进行纳米压痕实验。将直径约5 μm的聚苯乙烯微球粘到AFM探针微悬臂上（MSCT，A针，标定弹性常数为0.068 N/m）。以2 μm/s的速度进行力-压痕曲线测量，扫描范围2 μm[31]。在纳米压痕实验过程中，探针接触细胞表面后，控制压电陶瓷继续运动1.3 μm，使微球充分接触细胞[34]。微球尽量压在细胞核周围相对平坦区域内。每个实验条件进行3组独立实验，每组测试5个细胞，并收集约1000条力-压痕曲线，共15个细胞，约3000条力-压痕曲线。

    2.3?杨氏模量计算

    依据文献报道的方法测算AFM探针微悬臂的弹性常数[35]，根据胡克定律计算加载力[36]：

    其中，F0是加载力，k是带有微球的AFM探针微悬臂弹性常数，Δz是在纳米压痕测试过程中检测到的AFM探针微悬臂的Z轴方向的位移变化。杨氏模量通过赫兹模型计算获得，模型假设压痕区域较小时，该区域是连续且不可压缩的。研究证明，该模型可用于计算细胞弹性，计算方法见公式（2）[37]：

    其中，E是杨氏模量，是压痕深度，R是微球半径，v是泊松比。细胞被认为是线性、弹性、各向同性、不可压缩的，并且应变值较小，因此，泊松比为0.5。F（d）是当微球压在细胞上AFM探针微悬臂由于细胞的弹性而弯曲产生的反馈力。根据胡克定律计算F（d）：

    其中，Δd是當将微球压在细胞表面上时产生的挠度变化。利用软件Atomic J计算杨氏模量和反馈力。

    2.4?脂质体纳米药物的制备

    将卵磷脂（0.1 mmol/L）和胆固醇（0.1 mmol/L）溶解在3 mL氯仿中，将每500 μL溶液分装成一个样品，并用氩气干燥; 在真空干燥器中进一步过夜干燥，以去除有机溶剂，获得脂质体。为了装载药物，将脂质体与含有1 mmol/L DOX或CPT的1 mL PBS缓冲液水合，并在65℃下将脂质体和药物完全混合。将悬浮液在80℃的超低温冰箱中保持1 min，使悬浮液固化，并在室温下融化，转移至65℃的水浴中，并充分涡旋混合，重复上述过程5次。为了控制脂质体囊泡的尺寸，在脂质体制备装置（Avanti）中安装了两层150 nm的聚碳酸酯滤膜。控制温度为65℃，使脂质体在高温下挤出，并重复20次。最后，制得直径约150 nm的载药脂质体[38]。

    3?结果与讨论

    3.1?AFM纳米压痕技术评估药效的可行性

    细胞膜上进行基于AFM的纳米压痕测量的示意图如图1A所示。AFM探针接触细胞膜后，压电陶瓷继续向下移动恒定的距离，对细胞施压，导致AFM探针微悬臂偏转[34]，该偏转可由光电探测器记录并绘制力-压痕曲线。由于每种药物的特性不同，对细胞凋亡的影响也不同[39]。DOX是一种广谱抗癌药物，可抑制DNA的合成，促进癌细胞的凋亡，显示出对癌症的良好治疗效果[40]。DOX处理后，癌细胞的细胞膜硬度会降低[41]。因此，本研究选择DOX作为模型分子，检测基于AFM纳米压痕技术分析药物功效的可行性。

    图1B和1C分别为用不同浓度DOX和不同处理时间后HeLa细胞上的典型力-压痕曲线。横坐标表示压痕的深度，纵坐标表示反馈力，该力是在进行纳米压痕测量时由AFM探针悬臂的挠度变化转换而来的。在“0.0”点处，探针无限靠近细胞（接触点），随着压痕深度的增加，AFM探针悬臂的挠度增大。与未经处理的HeLa细胞（Control，反馈力为（1.58±0.07） nN，0.15 μm压痕处，曲线的最高点）相比，用0.5 mmol/L DOX处理细胞1 h后，反馈力降到（1.25±0.05） nN（0.34 μm压痕处）。压痕深度增加表明细胞变软，这是由于凋亡的癌细胞硬度降低[42]。随着处理细胞DOX浓度的增加，反馈力减小。将细胞与3 mmol/L的DOX共同孵育1 h后，反馈力仅为（0.35±0.07） nN（0.81 μm压痕处）。同时，反馈力也会随着处理细胞时间的延长而减小。值得注意的是，处理细胞4 h（0.5 mmol/L）后，反馈力虽然降低至（0.30±0.07） nN，但是压痕深度减小到0.55 μm，这可能是由于凋亡过程中细胞质收缩和凋亡小体的出现，阻碍了探针的下降[43]。计算了上述条件下HeLa细胞的杨氏模量（图1D），与HeLa细胞共孵育的DOX浓度从0 mmol/L增加到3 mmol/L（共孵育1 h），细胞的杨氏模量从（3480.21±398.36） Pa降到（1376.52±71.98） Pa。孵育时间从1 h延长到4 h（DOX浓度0.5 mmol/L），细胞的杨氏模量从（2838.19±71.85） Pa降到（1061.14±71.88） Pa。上述结果表明，药物治疗后，细胞骨架塌陷，细胞凋亡，导致细胞杨氏模量和反馈力的降低[44]，证明了AFM纳米压痕检测药物功效的可行性。

    3.2?基于AFM纳米压痕技术评估纳米药物功效

    通过改变药物亲和力，可加快细胞吞噬作用，因此，脂质体纳米药物受到越来越多的关注[45]。本研究进一步验证了基于AFM的纳米压痕技术分析纳米药物功效的可行性。通过机械挤压法合成了载有DOX（LDOX）和CPT（LCPT）的脂质体纳米药物[46]。纳米压痕测量发现，随着与细胞共孵育LDOX浓度的增加（0～0.5 mmol/L，1 h），细胞的杨氏模量从（3483.34±431.05） Pa降低到（1402.67±67.20） Pa。将细胞与LDOX（0.25 mmol/L）共孵育3 h后，细胞的杨氏模量从（2454.42±66.69） Pa（0.25 mmol/L，0.5 h）降低到（661.44±66.27） Pa（图2A）。对于不同浓度LCPT处理不同时间的细胞，杨氏模量分别从（2262.11±67.46） Pa降至（1349.71±66.61） Pa（0.125～0.5 mmol/L，1 h），以及从（2365.55±66.95） Pa降至（654.42±65.61） Pa（0.5～3.0 h，0.25 mmol/L，图2B）。因此，LCPT的作用与LDOX相似，这种类似的作用提供了两种药物在脂质体中混合使用的可能性。

    DOX和CPT混合的纳米药物可通过协同作用发挥更好的效果，但是DOX和CPT不同浓度比制得的混合药物可能显示出不同的药效。研究表明，DOX和CPT以摩尔比4∶1混合后药效较好，而以摩尔比1∶4混合的药效相对差一些[47]。将DOX和CPT以4∶1和1∶4（摩尔比）混合的脂质体纳米药物分别命名为L4∶1和L1∶4。在不同浓度和时间条件下分别检测了L4∶1和L1∶4的药物功效。如图2C和2D所示，细胞的杨氏模量随着共孵育时间的延长及L1∶4和L4∶1浓度的增加而降低。不同条件下，药物处理HeLa细胞后细胞的杨氏模量见表1。通过比较发现，L4∶1和L1∶4纳米药物均具有协同作用。在低浓度（0.125 mmol/L，1 h）下，LDOX（（2333.51±68.67） Pa）的药效略优于L1∶4（（2427.03±67.43） Pa）; 对于较长的共孵育时间（0.25 mmol/L，3 h），LDOX（（661.44±66.27） Pa）的药效也优于L1∶4（（770.58±67.40） Pa）。推测在低浓度下，这两种药物会发生相互作用，从而抑制药效; 而随着孵育时间延长，药物的浓度降低，两种药物也会发生相互作用而产生拮抗，与文献[40]报道结果相似。

    将不同组分的纳米药物在相同的药物浓度与孵育时间下进行药效对比（图3）。通过细胞杨氏模量的比较可反映药物功效趋势：游离药物<脂质体纳米药物<混合脂质体纳米药物，此结论与文献[48]一致，这是因为脂质体的生物相似性可促进药物的吸收，进而增强药效[49]。同时，在低浓度和较长孵育时间条件下，两种药物存在拮抗作用，会出现混合脂质体纳米药物功效比单一脂质体纳米药物功效差的现象。这些结果进一步证实了基于AFM纳米压痕技术评估纳米药物功效的可行性。

    3.3?测量细胞粘弹性评估纳米药物功效

    粘弹性可反映细胞活力，基于AFM的力-距离曲线可用于评估细胞的粘弹性行为。对于纯弹性物体，逼近曲线和缩回曲线在力-距离曲线中重叠。然而，在细胞上测量力-距离曲线的过程中，细胞膜的收缩因细胞塑性的增加而被抑制，在接近曲线和回缩曲线之间会有很大的间隙。为了量化细胞与纳米药物共孵育之前和之后的塑性，在用0.5 mmol/L L4∶1处理不同时间的HeLa细胞上进行了力-距离曲线测量。相对弹塑性行为用塑性指数ζ描述，塑性指数ζ可通过逼近曲线（A1）下的积分面积与缩回曲线（A2）下的积分面积之比确定（图4）[18，50]：

    典型的力-距离曲线如图5A所示。通过积分面积比拟合获得细胞塑性指数。当逼近曲线和缩回曲线重合时，A1=A2，细胞处于完全弹性状态，塑性指数ζ=0。如果A2=0，则细胞格是完全塑性的，ζ=100%。通常，细胞中，0<ζ<100%，它指示细胞的粘弹性行为[50]。对于空白脂质体（对照）处理的HeLa细胞，ζ0=25.11%±1.43%。与L4∶1（0.5 mmol/L）共同孵育0.5、1、2和3 h后，细胞的粘弹性分别为37.22%±1.48%、30.05%±1.37%、40.92%±0.91%和43.99%±1.37%（图5B）。0.5 mmol/L L4∶1处理细胞0.5 h后，由于粘着蛋白破坏了细胞膜表面，细胞的粘弹性先增加; 当孵育时间延长至1 h，粘弹性又降低。这是因为随着表面张力的增加，细胞从扁平变为球形，导致暂时的弹性恢复（塑性降低）; 隨着共同孵育时间的延长（2～3 h），内部细胞骨架坍塌，细胞质浓度增加，塑性值逐渐增高[51]。上述结果进一步表明了细胞的粘弹性用于分析纳米药物功效的直观效果。

    4?结 论

    通过AFM纳米压痕技术检测细胞的力学性能（包括反馈力、 压痕深度、 杨氏模量和粘弹性），实现了对纳米药物功效的分析。以DOX处理的细胞上验证基于AFM纳米压痕技术分析药物功效的可行性，分别研究了脂质体包裹的DOX、CPT以及CPT和DOX混合物的纳米药物功效。进一步验证了AFM纳米压痕技术分析纳米药物功效的可行性，发现在多数情况下，药物功效顺序为：游离药物<脂质体纳米药物<混合脂质体纳米药物，但在低浓度和长时间作用条件下，两种药物存在拮抗作用。通过测量比较了L4∶1处理不同时间后细胞的粘弹性，并进行了纳米药物功效评估。本研究为纳米药物筛选提供了一种有效的新方法。

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