痤疮合剂对兔耳痤疮模型外周血清炎性因子影响的实验研究

    于佳家　张小卿　吴景东　顾炜

    

    

    

    [摘要]目的：本研究旨在觀察痤疮合剂对兔耳痤疮模型外周血清炎性因子表达的影响。方法：Kligman和Fulton法制备兔耳痤疮模型，于兔耳内侧涂抹煤焦油，时间2周，待造模成功后，痤疮合剂组灌服痤疮合剂（17.52g/kg/d）30d;阳性组灌服清热暗疮胶囊（0.12g/kg/d）30d;空白组与模型组灌服同等剂量生理盐水。各组末次给药后，24h内取静脉血及局部皮肤组织病理活检。ELISA法检测各组家兔外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF水平，HE染色法观察兔耳组织病理变化。结果：痤疮合剂能有效减轻兔耳表皮层的厚度、脓肿、结节和兔耳毛囊开口收缩及扩张的程度，抑制毛囊漏斗内角质化物质的大量增殖，降低真皮炎症细胞的增生和浸润。除空白组外，各组血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α和GM-CSF表达水平在造模后均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;处理后，与模型组相比，痤疮合剂组和阳性组血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α和GM-CSF表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：痤疮合剂能通过降低外周血清炎性因子浓度，调节免疫功能而改善兔耳痤疮模型的病理表现。

    [关键词]痤疮合剂;兔耳痤疮模型;炎性因子;GM-CSF;白介素-3;肿瘤坏死因子α;白介素-13;白介素-4

    [中图分类号]R758.73+3? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）08-0027-04

    Experimental Study of Inflammatory Cytokines Effect of Acne Mixture Decoction on Rabbit Ear Acne Models

    YU Jia-jia1，ZHANG Xiao-qing1，WU Jing-dong2，GU Wei3

    （1.The First Clinical Graduate School， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China;2.The President's Office， the 2nd Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110036，Liaoning，China;3.Department of Dermatology Clinic， the Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110043，Liaoning，China）

    Abstract： Objective? To study the effect of Acne Mixture Decoction on the expression of inflammatory cytokines in peripheral blood of rabbit ear acne model. Methods? Rabbit ear acne model was prepared according to Kligman and Kwong method by applying coal tar to the internal surface of rabbit ears for 2 weeks. After confirming successful modeling， the mixture group was given Acne Mixture Decoction （17.52g/kg/d）， continuous dosing 30d. And the control group was given Clear Heat Acne Capsule （0.12g/kg/d）， continuous dosing 30d. The control group and the model group were given equal doses of saline solution respectively. Partial ear skin samples were biopsied within 24 hours after the last administration， and using ELISA to detect levels of IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in all groups.? Results? Acne Mixture Decoction can significantly reduce the abscess and nodules， reduce thickness of the rabbit ear epidermal and follicle funnel expansion， inhibit proliferation of keratinized compounds in follicle funnel， and reduce dermal inflammatory cell infiltration. Except the blank group， the expression levels of serum IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in each group were significantly increased after modeling， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， levels of IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in the mixture group and the positive control group were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion? Acne Mixture decoction can improve the pathological symptoms of rabbit ear acne model by reducing the concentration level of inflammatory cytokines in peripheral blood and regulating immune function.

    Key words： acne mixture; rabbit ear acne model; inflammatory cytokine; GM-CSF; IL-3; TNF-α; IL-13; IL-4

    痤疮属传统中医“粉刺”的治疗范畴，青春期发病率高，患者会出现不同程度和症状的皮损性临床表现，中国区患病率为39.3%[1]，欧洲为57.8%[2]。该病主要发生在皮脂丰盈的面部、胸背，轻则皮肤脓疱和丘疹，重则凹凸瘢痕，甚至引起面部皮损性毁容，给患者带来极大的情志压力负担。现代西医研究认为，炎症反应、皮脂腺角质化异常、P.Acne（痤疮丙酸杆菌）定植、皮脂分泌过多和情志心理因素等都是影响本病早期发病的机制，其中免疫功能异常是影响本病的重要病理学因素[3]。因此，本实验以痤疮合剂（辽宁中医药大学附属医院院内制剂）作为主要研究因素，以解痈散结，清上焦（肺）、中焦（胃）之湿热为诊治原则，观察痤疮合剂对兔耳痤疮的病理学影响，探讨该方剂调节炎症介质在本病发病中的免疫级联效应的作用。

    1? 材料和方法

    1.1 实验动物：健康雄性新西兰SPF级大白兔32只，年龄（11.81±0.7）周，体重（1.94±0.38）kg，沈阳滕华生物技术有限公司提供，许可证号：scxk（辽）2018-0002。于室内湿度35%～65%，室内温度18℃～22℃的辽宁中医药大学实验动物中心（SPF级）动物室饲养，许可证号：syxk（辽）2013-0009，昼夜交替12h，单笼饲养。本次实验动物通过了辽宁中医药大学实验动物伦理委员会伦理审查，审查编号2019CS（DW）-004-001。

    1.2 药品及试剂：痤疮合剂（辽宁中医药大学附属医院药剂），主要构成：夏枯草，防风，生地黄，枇杷叶，黄连等;清热暗疮胶囊（国药准字Z20080425），江西普正制药有限公司生产。煤焦油（批号：99891）;GM-CSF试剂盒（批号：F20061），上海西唐生物科技有限公司生产;IL-3试剂盒（批号：10701-H08H/R009），Sino Biological公司生產;TNF-α试剂盒（批号：SEA133Rb），武汉优尔生商贸有限公司生产;IL-13试剂盒（批号：ab119462），abcam公司生产;IL-4试剂盒（批号：SEA077Rb），武汉优尔生商贸有限公司生产。

    1.3 主要仪器：酶标仪（Anthos2010型）;生物显微镜（CHA型）;脱水机（LEICA 300）;石蜡包埋机（EG1150）;切片机（LEICA RM2235）;恒温水浴振荡器（SHA-B）;离心机（PB300）;电热恒温培养箱（HH·B11·500型）。

    1.4 实验方法

    1.4.1 分组：新西兰大耳兔购买后，喂养1周观察其适应性，无死亡。分组方法应用随机数字表：①空白组;②模型组;③痤疮合剂组;④阳性组;每组8只。

    1.4.2 痤疮动物模型的建立及干预方案

    1.4.2.1 环境适应期：新西兰大耳兔适应性观察饲养1周（每笼1只，室内控温20℃～25℃，12h光照，12h黑暗）。以玉米、大豆、麦麸、牧草为主成分的颗粒状饲料，配饲卷心菜和胡萝卜喂养，不限饮水量及进食量。

    1.4.2.2 动物造模：根据1989年美国皮肤病学会正式颁布的Kligman和Fulton造模法[4]制备兔耳模型，兔耳内侧位于耳管近端约2cm×2cm位置，用医用棉签沾涂0.4～0.6ml煤焦油，每日1次，持续2周后，取兔耳组织病变部位，经组织学检查造模成功后，再实施后续实验。

    1.4.2.3 干预方案：痤疮合剂每日的临床成人用量为58.48g，均分两次口服，按人兔等效剂量法换算2.92g/kg/d。本实验根据以往研究结果，药物剂量确定为中剂量，按6倍的人兔等效剂量换算17.52g/kg/d，2次/d灌服。清热暗疮胶囊的临床成人用量为2.5g，按人兔等效剂量法换算0.12g/kg/d，去胶囊，药粉溶于生理盐水，2次/d灌服，空白组及模型组等剂量灌服生理盐水，连续30d。

    1.4.2.4 血清采集及组织取材：10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后提取腹主动脉血，60min静置，3 000r/m离心10min，提取血清2ml置于-80℃冰箱中冻存，ELISA法检测外周血GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13和IL-4水平。家兔左耳耳管采血后，经耳缘静脉注入20ml空气栓塞处死，用1cm打孔器分别在家兔右耳耳管开口处取皮样组织，10%多聚甲醛固定，置以石蜡包埋后制备病理切片。

    1.5 指标检测

    1.5.1 兔耳组织病理：取固定的兔耳组织，流动水下完全冲洗，常规方法脱水、浸蜡、包埋，轮转式切片机制备4μm超薄兔耳切片，脱蜡后行苏木素-伊红（HE）染色，Digital显微镜下静置观察兔耳组织病理学改变。

    1.5.2 血清炎性因子含量检测：采用ELISA检测方法检测各组家兔血清IL-4、IL-13、IL-3、GM-CSF及TNF-α水平变化。

    1.6 统计学分析：实验数据资料采用SPSS 22.0统计软件包分析处理，各组计量资料采用单因素方差分析，结果以均数±标准差（x?±s）表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

    2? 结果

    2.1 造模情况：空白组家兔耳体薄、质地软、毛细血管结构清晰，耳道开口区毛囊未见角栓并排列有序;模型组造模后14d，涂有煤焦油处的耳部出现不同程度红肿，毛囊口有鼓起，且伴有多个增生性粉刺样结节，皮损部位的表皮层较厚，可见大面积黑色粉刺状角栓;痤疮合剂组兔耳表皮层薄厚不一，结节和毛囊角栓溢出见少，角栓脱落部位留有坑状的大毛囊，丘疹数量减少;阳性组表皮损伤修复程度与痤疮合剂组疗效接近。

    2.2 兔耳病理改变：空白组兔耳皮肤各层结构完整，表皮层较薄，表皮与真皮边界清晰，皮下组织无炎性细胞浸润和小血管扩张等病理结构改变;模型组上皮出现特异性角化且明显角化不全，颗粒层及棘细胞层组织增厚，真皮浅层可见小血管扩张及肿胀，炎性细胞浸润，角化物质大量聚集毛囊漏斗处形成角化栓;痤疮合剂组兔耳表皮角化程度明显缓和，增厚的颗粒层及棘细胞层显著变薄，真皮浅层炎症细胞减少明显，部分小血管轻微扩张，毛囊漏斗内聚集少量的角化物;阳性组毛囊扩张不明显，炎性细胞浸润显著改善。见图1～4。

    2.3 血清炎性因子水平：处理后，空白组外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF浓度低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）;痤疮合剂组和阳性组外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF浓度低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。见图5。

    3? 讨论

    痤疮的病因病机早在《内经》中就已形成辨证论治的理论，认为痤疮为上焦（肺经）、中焦（胃经）、下焦（大肠经）郁之热邪所致。近年来许多中医名家提出了湿热、血瘀痰结、气血凝塞等理论，并以燥湿、清热、活血、散痈、化瘀、解毒为治疗原则。笔者医院通过观察中药治疗痤疮的临床疗效并结合现代医学对痤疮发病机制的认知，精研出痤疮合剂，治疗以解毒散痈，清泻上焦和中焦湿热为原则，用连翘和金银花相须使用可清热解毒、透邪、消痈散结，适用于肺热所致肺风粉刺症，黄芩清肺热，消痈肿疮毒，黄连泻胃火治疮毒，两药配伍清热除湿解毒;枇杷叶苦寒，有清泻肺胃之热、利尿、止渴的功效;桑白皮既能助枇杷叶清肺热，又兼利水，可使热随小便而去，与黄芩三药搭配清泄肺胃积热、降逆气，药理研究证明，黄芩、枇杷叶、桑白皮均有抑炎和抗炎作用[5]。沙参润肺燥、养胃阴，防邪热过盛而伤阴液;其药理成分沙参多糖可抑制体液、细胞免疫，能调节和平衡免疫功能[5]。夏枯草散结泄热消肿，抗病原微生物。牡蛎软坚散结，配夏枯草可清火消痈散结，增强免疫。牛蒡子宣肺透疹，可治斑疹不透或痈肿疮毒;防风升清燥湿，可祛隐疹固表;蝉蜕散肺经风热而透疹;葛根发表透疹，以上四味搭配，上宣下透，外清內消，助疹毒于肌表散之，热邪于肠道泻之。热入营血而久蕴化热成毒，气血郁而经脉失畅，以地黄配牡丹皮苦寒凉血化瘀;川芎性善行窜，通气血;香附解郁疏肝止痛，气行血畅，则热毒火邪自解。此方临床疗效确切，治则基于“清泻上中焦积热，解毒凉血，活血化瘀散痈”的中医理论，为进一步探讨痤疮合剂的免疫学机制奠定实验基础。

    痤疮疾病的具体发病机制受多种因素影响，归纳综合病因有：①皮脂分泌亢进;②角质化异常;③炎症反应;④痤疮丙酸杆菌（P.Acne）定植。Melnik等[6-7]发现免疫功能异常是本病的另一个重要致病因素，且不排除多种细胞类型及介质诱导加剧刺激其炎症反应。传统观点认为，微粉刺是痤疮发病的亚临床表现，在雄激素的病理刺激下，导致皮脂大量分泌，借此P.Acnes在毛囊内大量繁殖，进一步激发皮脂分泌和堆积，继而促进毛囊皮脂腺过度角化，周而复始引起皮脂腺导管栓塞，最终由固有免疫系统诱导炎症反应[8]。异常的皮脂分泌、腺体角化、毛囊栓塞、P.Acne增殖皆是影响和改变皮脂腺周围环境的初始因素。Jeremy等在2003年研究发现炎症反应至始至终贯穿整个P.Acnes发病过程，并揭示炎症就是痤疮疾病的刺激因素，经观察患者非病变皮肤皮脂腺周围有明显的炎症因子（CD4细胞、巨噬细胞、IL-1α水平均高于空白组），提示炎症浸润早于增生，炎症介质是诱导P.Acnes发生发展的至关因素。

    炎症的基本特征是促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间相互交织的互联集落，彼此间的极化博弈决定炎症反应的趋向性。P.Acne通过多种促炎途径直接启动固有免疫系统，介导表皮主要细胞（角质形成细胞和皮脂腺细胞）激活TLR，并诱导TNF-α、GM-CSF和其他促炎细胞因子的产生，或以触发炎性小体的激活途径，导致杀伤细胞（粒细胞和巨噬细胞）趋化及聚集，诱导免疫炎症反应[3]。GM-CSF是免疫调节因子的一种，可以刺激髓样单核细胞（如DCs）的增殖、分化，参与炎症和慢性炎症反应[9]，且具有促进伤口愈合和组织修复功能[10]。IL-3与GM-CSF同属β细胞因子家族，是激活固有免疫的中心介子，在宿主防御和炎症反应中发挥重要功能[11]。IL-4是固有免疫细胞的生长因子，与IL-13共同作用刺激肥大细胞的生长和增殖，参与皮肤病炎性反应[12]。TNF-α被认为在各种免疫疾病和皮肤炎症中启动级联激活，促进炎性介质释放，造成免疫炎症反应扩大，进而引起痤疮的特异性免疫反应[13]。因此，本实验采用ELISA检测痤疮模型外周血GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13及IL-4水平，探讨炎性细胞因子在痤疮发生发展过程中的免疫调控趋势。

    炎症反应、免疫应答是参与和影响痤疮病理变化的免疫功能机制，可导致机体免疫调节机能的失衡。痤疮合剂能降低家兔外周血免疫因子GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13及IL-4表达，抑制炎症细胞浸润，逃避免疫监视，从而阻断炎症级联反应;从病理上可改善炎性皮损、结节、毛囊角栓及小血管充血，证明痤疮合剂对兔耳痤疮模型有较好的抗炎及抑炎作用。

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    [收稿日期]2019-12-12

    本文引用格式：于佳家，张小卿，吴景东，等.痤疮合剂对兔耳痤疮模型外周血清炎性因子影响的实验研究[J].中国美容医学，2020，29（8）：27-30.