辣椒素对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用

    陈凤东 秦杏清 梁微霞 张婷婷 黎昀 王映

    

    

    

    【摘要】 目的 研究辣椒素解酒作用及其对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用。

    方法 将实验小鼠随机分为正常对照组、模型组及辣椒素低（5 mg/kg）、中（10 mg/kg）、高（20 mg/kg）三个剂量组，连续14天灌服给药：正常对照组、模型组灌服蒸馏水，辣椒素低、中、高剂量组分别灌服相应药物;第14天末次给药后1 h，除正常对照组外，模型组和辣椒素低、中、高剂量组均给予56%酒精灌胃，并建立急性酒精性肝损伤模型。观察醉酒及醒酒时间，计算肝脏指数，检测血清中AST、ALT、TG的水平，观察肝脏病理学变化。

    结果 成功建立小鼠急性酒精性肝损伤模型;辣椒素可延缓醉酒时间，缩短醒酒时间，降低肝脏指数，有效降低血清ALT、AST活性;病理检查结果显示，辣椒素可改善肝组织损伤，以辣椒素中剂量组作用最为明显。

    结论 辣椒素有解酒作用，并可有效保护急性酒精性肝损伤。

    【关键词】 辣椒素;急性酒精性肝损伤;保护作用

    中图分类号：R575 ? 文献标志码：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.08.003

    【Abstract】 Objective To study the antialcoholism effect of capsaicin and its protective effect on acute alcoholic liver injury in mice.

    Methods Mice were randomly divided into normal control group，model group，low-dose capsaicin group（5 mg/kg），medium-dose capsaicin group（10 mg/kg） and high-dose capsaicin group（20 mg/kg）.All groups were given continuous administration for 14 days.The normal control group and the model group were given distilled water，and the corresponding drugs were administered in the low-dose capsaicin group，medium-dose capsaicin group and high-dose capsaicin group.Except the normal control group，low-dose capsaicin group，medium-dose capsaicin group and high-dose capsaicin group were given gavage by 56% alcohol on one hour after the last administration on the 14th day，and the acute alcoholic liver injury model was established.The time of drunkenness and sobriety was observed，the liver indexes were calculated，the levels of AST，ALT and TG in serum were detected，and the pathological changes of liver were observed.

    Results The model of acute alcoholic liver injury was established successfully.Capsaicin could delay the time of intoxication，shorten the time of sobriety，reduce the liver indexes，and effectively reduce the activity of serum ALT and AST.Pathological examination showed that capsaicin could improve liver tissue damage，especially in the medium-dose capsaicin group.

    Conclusion Capsicum has the effect of antialcoholic，and effectively protect acute alcoholic liver injury.

    【Key words】 capsaicine;acute alcoholic liver injury;protective effects

    酒精性肝損伤的主要原因是氧化应激，酒精体内代谢的重要场所是肝脏，自由基在其代谢过程中大量产生，众多研究表明自由基通过参与细胞膜脂质过氧化代谢，造成细胞损伤[1～2]。当肝脏中活性自由基过量，将导致抗氧化系统失衡，炎症因子大量积聚促发炎症反应，从而引起肝脏损伤。辣椒素是从辣椒中提取的主要活性成分，具有调节免疫，清除活性氧自由基，改善线粒体活性等功效[3～4]。应用辣椒素对肝脏氧化还原过程和线粒体生物能量功能有较好的改善作用[5～6]，但辣椒素对急性酒精性肝脏损伤是否具有保护作用尚不明确。因此，本实验将研究辣椒素对小鼠急性酒精性肝损伤是否具有保护作用。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    健康KM小鼠60只，雄性，体重22～24 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2019-0014，合格证号：1107261911000853。

    1.2 主要试剂及仪器

    98%辣椒素（北京百灵威科技有限公司，批号：104687），95%乙醇（北海国发海洋生物产业股份有限公司制药厂，批号：190807），加蒸馏水稀释备用。吐温-80（广州穗泽环保科技有限公司，批号1701140611）。精密电子天平、低温离心机、7600型全自动生化分析仪（购自株式会社日立高新技术公司）、病理制片仪等。

    1.3 动物分组、给药与造模

    实验小鼠饲养环境24℃～27℃，60只健康雄性小鼠适应性喂养3天。按体重随机分为正常对照组、模型组及辣椒素低、中、高三个剂量组共五组，每组12只。每天1次，连续14天灌服给药。正常对照组、模型组分别按0.1 mL/10 g体重灌服蒸馏水，其余各组分别灌服相应剂量辣椒素（分别为低剂量组5 mg/kg，中剂量组10 mg/kg，高剂量组20 mg/kg）[5];第14天末次给药后1 h，除正常对照组外其余各组按0.15 mL/10 g剂量一次性灌胃56%酒精（用95%乙醇稀释，下同）造模，建立小鼠急性酒精性肝损伤模型[7]，灌胃56%酒精后小鼠禁食不禁水。

    1.4 指标检测及方法

    1.4.1 一般情况及醉酒、醒酒时间观察

    观察各组动物的一般情况，包括精神、活动状况、饮食、排便等。每隔2天称小鼠体重，酒精造模前的小鼠体重作为给药参照值。酒精灌胃后，小鼠少动嗜睡。醉酒时间记为从给药开始到翻正反射消失为止，醒酒时间记为翻正反射恢复的时间。

    1.4.2 血清生化指标测定

    第14天灌胃酒精造模成功12 h后，眼球静脉取血，血液静置2.5 h，于4℃低温下进行离心，2500 r/min离心10 min后取上清液，使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT、AST及TG水平。

    1.4.3 肝指数计算

    眼球静脉取血后处死小鼠，剖取肝脏，生理盐水清洗，滤纸吸水后称重。计算肝脏指数=[肝脏重量（g）/小鼠体重（g）]×100%[8]。

    1.4.4 肝组织病理检查

    取小鼠肝左叶同一部位，立即采用10%甲醛固定，接着用酒精梯度脱水（70%、80%、90%、95%、100%的酒精各脱水30 min），先用二甲苯透明石蜡包埋肝组织，后切片脱蜡，HE染色，中性树胶封片。显微镜下观察肝脏病理组织[9]的变化。根据肝脏病变程度如肝细胞的形态变化、炎症反应、纤维化、脂肪空泡进行肝脏组织切片病理学评估。

    1.5 统计学方法

    采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，计量资料以（±s）表示，两组间比较采用 LSD-t检验。检验水准：α=0.05，双侧检验。

    2 结 ?果

    2.1 一般情况

    造模前小鼠生活状态正常，毛色光泽，黑褐色颗粒样大便;进食及饮水均正常，体重增加明显。造模前1小时测量体重，各组小鼠间体重差异无统计学意义。给予酒精造模后，除正常对照组外，其余各组小鼠先表现为行动缓慢而少，转而进入嗜睡及翻正反射消失等醉酒状态;进食少，毛散乱。

    2.2 辣椒素对酒精中毒小鼠的影响

    酒精灌胃造模的小鼠因酒精中毒而出现嗜睡，主要表现为翻正反射消失，经过一定时间翻正反射会恢复。各组小鼠间醉酒时间和醒酒时间有差异，与模型组比较，辣椒素各剂量组出现醉酒的时间明显延后，而醒酒时间相对缩短，差异有统计学意义（P<0.05）;与辣椒素低剂量组比较，辣椒素中剂量组醒酒时间缩短（P<0.01），辣椒素高剂量组醒酒时间延长（P<0.05）;与辣椒素中剂量组比较，辣椒素高剂量组醉酒时间缩短（P<0.05），而醒酒时间延长（P<0.01）;相较而言，辣椒素中剂量组对酒精中毒小鼠的解酒功能较好。见表1。

    2.3 各组急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数比较

    结果显示：与正常对照组比较，模型组造模后小鼠体重明显下降（P<0.01），肝脏指数显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）;辣椒素各剂量组与模型组比较，肝脏指数下降明显，差异有统计学意义（P<0.05）;与辣椒素低剂量组比较，辣椒素中、高剂量组肝脏指数下降较明显（P<0.05）。见表2。

    2.4 各组急性酒精性肝损伤小鼠肝功能指标的比较

    实验结果显示，模型组与正常对照组比较，其血清ALT、AST水平均有明显升高（P<0.01），表明造模成功，小鼠经一次性灌胃56%酒精后出现肝脏损伤;辣椒素各剂量组与模型组比较，小鼠的血清ALT、AST水平都降低（均P<0.01）;辣椒素各剂量组之间比较，差异无统计学意义。凡是应用酒精造模的小鼠其血清中TG浓度均有不同程度升高，但不具有统计学意义。结果见表3。

    2.5 辣椒素对小鼠肝组织病理变化的影响

    图1为各实验组小鼠肝脏的病理切片图。正常对照组的小鼠肝组织结构完好，细胞索排布规整，围绕中央静脉呈发散状排列，细胞核染色较深，圆形居中;模型组小鼠肝细胞索紊乱，界限模糊，形态大小不一，可见肝细胞肿胀、气球样变及细胞内大量脂肪空泡，局部散在肝细胞坏死;与酒精模型组相比较，改善程度最明显的是辣椒素中剂量组，该组肝小叶结构较为清晰，肝索排布程度较规整，肝组织结构趋向正常，细胞内脂肪空泡数量较少。病理组织结果显示：模型组小鼠急性大量酒精摄入导致肝细胞病理损伤，辣椒素低、中、高剂量组对酒精性肝损伤起到一定的保护作用。

    3 讨 ?论

    短时间大量饮酒会损伤肝组织，主要和抗氧化损伤、脂质过氧化及免疫损伤等因素相关[10]。體内摄入过多酒精，可使自由基的产生和清除失衡，致使脂质过氧化，机体抗氧化能力也会减低，从而引起肝细胞损伤，临床可见肝细胞气球样变性、肝功能指标异常等。辣椒素是从辣椒中提取的主要活性成分，研究表明其具有抗氧化、清除活性氧自由基和改善线粒体活性等作用[11]。降低肝脏的氧化应激反应，从而达到醒酒护肝作用是近年来中医药研究的热点[12]。本实验结果显示应用辣椒素可以显著延缓醉酒时间同时又能缩短醒酒时间，可见辣椒素具有解酒功能。

    在机体中，肝脏的免疫细胞有强大的吞噬功能和防御免疫能力[13]。因此，肝脏指数变化是本研究的观测指标之一。实验表明与模型组相比，辣椒素低、中、高剂量组的肝脏指数均降低，说明辣椒素可降低急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏指数，对肝脏损伤具有一定的保护作用。ALT和AST是存在于肝细胞质和线粒体中的转氨酶，当肝细胞受损发生变性、坏死时，ALT和AST就会进入血液，血清中两者含量会明显增加。因此，ALT和AST水平高低在一定区间可反映肝脏损伤程度，而肝脏活检被认为是判断肝脏损伤的金标准[14]。本实验采用的方法是单次大量高浓度酒精灌胃构建急性酒精性肝损伤模型，结果显示模型组小鼠血清ALT和AST水平明显升高，镜下可见肝细胞形态异常和脂肪变性等病理改变，这些实验结果证实了小鼠急性酒精性肝脏损伤模型建立成功[15]。同时我们在研究中发现，与模型组相比，应用低、中剂量的辣椒素可使酒精中毒小鼠的血清ALT、AST酶活性降低。此外，各组小鼠肝组织病理切片结果表明，模型组小鼠肝细胞索排布紊乱，界限不清，细胞形态大小不一，肝细胞膨大如气球，脂质透明可见细胞内大小不等的脂肪空泡、肝细胞坏死等组织损伤表现。而经辣椒素干预后各组小鼠肝组织病理变化有较大的改善，肝细胞结构明显改善，细胞膨大、气球样变及脂肪空泡等病理损伤程度减轻。所有经酒精造模的小鼠血清总胆固醇普遍增高，但与正常对照组比较差异不明显，结合各组小鼠病理学检查存在细胞内脂肪空泡的显著差异，可见脂肪空泡是肝损伤的病理表现而非血脂、体脂升高导致的脂肪代谢异常所致，辣椒素的确有显著的改善效用。因此，应用辣椒素预处理能较好地预防或保护急性酒精性肝损伤。

    本研究中，辣椒素中剂量组的解酒功能及其对肝组织酒精性损伤的保护作用，效果优于高剂量组，提示可能为辣椒素浓度达到一定峰值后，再提高剂量反而影响其吸收，进而影响药效;也可能吸收正常，但高剂量已超过最佳药效浓度，因此药效不如中剂量组。

    总之，辣椒素对急性酒精性肝损伤的保护作用，可能与改善脂质过氧化、增强受损肝脏抗氧化能力、减少炎症反应有关，其作用机制需要更进一步的研究探索。

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    （收稿日期：2020-03-03 修回日期：2020-05-07）

    （编辑：潘明志）