大青叶抗胸膜肺炎放线杆菌活性部位的初步分离

    阳刚　白璐　李正文

    摘要：提取分离大青叶并测定各级提取物对猪胸膜肺炎放线杆菌的抑菌活性。采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC）以追踪大青叶的活性部位及其活性成分。采用80%的乙醇提取并通过硅胶柱色谱法对其进一步分离，测定抑菌活性，追踪其活性段。同时以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水依次提取，测定抑菌活性，并对提取物的化学成分进行初步分析。硅胶柱色谱各分离组分对试验菌均有不同程度的抑制作用，抑菌效果最好的为组分3，其MIC为3.91 mg/mL。各级提取物中抑菌活性较好的为乙酸乙酯提取物，其MIC为3.91 mg/mL。其抑制胸膜肺炎放线杆菌生长的主要成分可能为生物碱、有机酸和黄酮类物质。

    关键词：大青叶；硅胶柱色谱；系统溶剂提取；抑菌活性；成分分析

    中图分类号：S852.6 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）10-0007-04

    大青叶是十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥叶，具有清热、解毒、凉血、止血等功效，用于治疗热毒发斑、丹毒、咽喉肿痛、口舌生疮、疮痈肿毒等症。现代药理研究表明其具有广泛的抗菌作用，对革兰氏阴性和阳性菌具有较好的效果[1-3]。目前关于大青叶抑菌活性的报道集中在其各级提取物，缺少对其抑菌成分的进一步研究[4]。本试验通过不同提取分离方法，以猪胸膜放线杆菌为试验菌，采用二倍稀释法测定最小抑菌浓度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC），追踪其抑菌的活性部位或活性成分，为进一步分离大青叶中抗胸膜肺炎放线杆菌活性物质提供基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    大青叶（产地河北）购置于四川雅安惠民堂药业连锁有限责任公司。猪胸膜肺炎放线杆菌购买于中国兽药监察所，编号为ATCC 265。

    1.2 主要试剂及仪器

    氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜等有机试剂，均为分析纯，购于成都市科龙化工试剂厂。茚三酮、碘化铋钾、硅钨酸、三氯化铁、三氯化铝、浓硫酸、浓盐酸、溴甲酚绿、醋酸镁、盐酸羟胺、4-氨基安替比林、硫酸铜、酒石酸钾钠、明胶、氢氧化钠、氢氧化钾等分析试剂。电热套，电子天平，灭菌锅，索氏提取器，旋转蒸发仪等。

    1.3 培养基

    含0.02% NAD的TSB和含0.02% NAD的TSA。

    1.4 方法

    1.4.1 大青叶80%乙醇提取 准确称定100 g大青叶粉末，80%乙醇，60 ℃索氏回流提取，料液比1∶10，每次8 h，共3次，抽滤，旋转蒸发至无乙醇味，25 ℃下避光干燥至浸膏状备用，并计算提取率。

    （1）大青叶薄层条件的筛选。经过筛选，甲苯-氯仿-丙酮（5∶5∶4）有较好的分离效果。

    （2）大青叶的硅胶色谱分离。100～200目硅胶共600 g，5 g浸膏以200～300目硅胶拌样，真空干燥，干法上样，以甲苯-氯仿-丙酮（5∶5∶4）梯度洗脱，每25 mL收集一次。根据TCL检测合并相同组分，得到5个组分。

    1.4.2 系统溶剂法提取 准确称量100 g大青叶粉末，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水，4 ℃提取，每次8 h，相同溶剂每次重复3次，合并相同组分；合并后的萃取液旋转蒸发浓缩至无有机溶剂味，25 ℃下避光干燥至浸膏状备用，并计算提取率。

    1.4.3 抑菌效果的测定

    （1）菌悬液的制备。将胸膜放线杆菌接种到含0.02%的TSA培养基中，37 ℃培养24 h，培养好后挑选单个菌落，接种于无菌试管中，涂板计数，以无菌蒸馏水稀释至106 CFU/mL备用。

    （2）最小抑菌浓度的测定。将各提取部分以二甲亚砜溶解，配置成一定浓度的溶液。96孔板，无菌操作，首先在每排1～10孔内分别依次加入含0.02% NAD的TSB液体100 μL，然后再每排第一孔再加入100 μL药液，混合均匀后取100 μL到第2孔，依次混合稀释直至第10孔。完成上述操作后，取制备好的细菌，向每孔加入100 μL菌液（106 CFU/mL），使菌液浓度最终为5×105 CFU/mL。第11孔为阴性对照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL药液），12孔为阳性对照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL菌液），另取一孔作为空白对照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL二甲亚砜），各组分平行3次。混匀，37 ℃恒温培养24 h。在阳性对照组溶液浑浊，阴性对照组溶液澄清的情况下，且在二甲亚砜没有抑制胸膜放线杆菌生长的浓度下，与对照组比较，试验组眼观溶液澄清、颜色未发生变化的最低药物浓度则作为该药的MIC。

    （3）最小杀菌浓度的测定。试验组澄清的各孔中液体接种涂布于TSA固体培养基平板，37 ℃培养24～48 h，观察有无细菌生长。平皿培养基中计数少于5个菌落，该药物浓度值为其MBC值[5]。

    1.4.4 各级提取物成分的初步分析 将各级提取物按照天然药物化学成分系统预试验方法，对其成分进行初步分析[6，7]。化合物定性鉴定标准见表1。

    2 结果与分析

    2.1 80%乙醇提取物体外抑菌效果

    大青叶80%乙醇提取物及其硅胶色谱各分离组分的体外抑菌效果见表2。由表2可知，各分离产物对猪胸膜放线杆菌均有较好的抑制作用，其分离产物中的3和4两个组分有很强的抑菌效果，其MIC分别为3.91、7.82 mg/mL，其MBC值分别为7.82、15.63 mg/mL。其次分离组分1、组分2、组分5的MIC值均為31.25 mg/mL。

    2.2 系統溶剂提取法提取物的体外抑菌效果

    大青叶系统溶剂提取法提取产物的体外抑菌效果见表3。由表3可知，各组分对猪胸膜放线杆菌均有较强的抑制效果。其中以乙酸乙酯提取物的抑菌能力最好，其MIC为3.91 mg/mL，MBC也较其他组分低，为7.82 mg/mL，其次为丙酮提取物，其MIC为7.82 mg/mL。氯仿提取物MIC为15.63 mg/mL，石油醚和甲醇提取物抑菌效果较差，为31.25 mg/mL。大青叶的水提物的MIC为62.50 mg/mL。

    2.3 大青叶系统溶剂提取的各级提取物定性试验结果

    为了初步判断抑菌活性部位的成分，对其成分进行了初步定性分析。大青叶系统溶剂法各级提取物的定性试验结果见表4。由表4可初步判断，石油醚提取物中主要含有油脂和甾体成分。氯仿提取物中主要存在黄酮类、有机酸、油脂。乙酸乙酯和丙酮提取物中主要存在生物碱、黄酮类和有机酸。甲醇和水提取物中含有氨基酸、糖类及黄酮类物质。水提取物还含有皂苷。

    3 讨论

    猪胸膜放线杆菌主要引起以急性胸膜肺炎为特征的呼吸道传染性疾病，是临床上的常见疾病，给养殖业造成的危害巨大[6，7]。临床多用青霉素、四环素、磺胺类药物治疗。唐万勇等[8]研究氟苯尼考、多西环素、TMP和黏杆菌素对胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌效果，结果表明抑菌效果显著。但长期使用抗生素不仅会造成细菌耐药性增加也会使抗生素在动物体内残留，进而威胁人类健康[9，10]。我国中药资源丰富，从传统中药材中找到抗生素的代替品，避免细菌对抗生素的长期耐药，缓解抗生素短缺是目前研究的热点[11，12]。刘仁志等[13]研究表明大蒜挥发油和广藿香挥发油的复方制剂对猪胸膜肺炎放线杆菌的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为3.9 mg/mL和7.8 mg/mL。康帅等[14]通过对乌梅等20种中药对猪胸膜肺炎放线杆菌的体外抑菌活性试验筛选，发现大青叶80%乙醇提取物对胸膜肺炎放线杆菌有较好抑制效果。大青叶作为传统纯天然药物，其毒性低、副作用小、不易产生耐药性，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有较为明显的效果，是药物开发的理想对象[15]。本试验对大青叶80%乙醇索氏回流提取物进行层析分离，进一步追踪其活性部位。硅胶柱色谱法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，首先洗脱下来的是极性较小的组分。通过层析分离，在得到的组分中，抑菌活性较好的部分为3、4两个组分，其MIC分别为3.91 mg/mL和7.82 mg/mL。然而，硅胶柱色谱法进行分离由于温度、上样量、流速和其他人为因素的影响，不利于进一步的分离工作[16]。因此改用系统溶剂提取法对其抑菌活性部位进行追踪并对其成分进行初步的定性分析。试验表明石油醚提取物抑菌性能相对不强，而大青叶的各级提取物中乙酸乙酯提取物对猪胸膜放线杆菌有很强的抑制作用，为3.91 mg/mL。丙酮提取物也有很好的效果，其MIC为7.82 mg/mL。说明大青叶中的抗菌有效成分主要在乙酸乙酯等中大极性的溶液当中。这可能与乙酸乙酯与丙酮极性较为相近，其提取的产物相近有关。通过初步定性分析，其抗菌有效成分可能为生物碱和黄酮类成分。生物碱及黄酮类化合物资源丰富，抗菌谱广，对包括耐药菌在内的菌株具有良好的抗菌效果[17，18]。刘军锋等[19]采用抑菌圈法测定了苦参碱等5种生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性，结果表明5种生物碱对3种细菌生长均具有显著的抑制作用。豁银强等[20]发现银杏叶黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抗菌作用。研究表明，生物碱及黄酮类化合物抗菌作用机制可能与菌体细胞壁、细胞膜的破坏及膜通透性的改变、相关酶和外排泵的抑制、影响菌体DNA和相关蛋白合成等多个方面有关[21，22]。大青叶对猪胸膜肺炎防线杆菌的抗菌机制还有待进一步研究。

    4 小结

    试验对大青叶的各级提取物对猪胸膜放线杆菌体外抑菌活性进行研究，证明了大青叶对猪胸膜放线杆菌有较高抑菌活性的部位在乙酸乙酯和丙酮提取部位，通过初步定性分析，其抗菌有效成分可能为生物碱和黄酮类成分，为进一步分离大青叶抗胸膜肺炎放线杆菌奠定了基础。

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