华蟾素在泌尿系肿瘤中的治疗研究进展
吴潇芸 易楚繁 付伟金
[专家介绍]付伟金， 医学博士，主任医师，硕士研究生导师，毕业于复旦大学，德国鲁尔大学和美国德克萨斯大学访问学者。现任中国医疗保健国际交流促进会泌尿健康促进分会术后快速康复学部委员，广西医师协会泌尿外科分会常委，广西医学会泌尿外科分会委员等。主要从事泌尿系统肿瘤的基础和临床研究。目前主持国家及省部级课题4项，已培养研究生7名，在读硕士研究生8名。自2005年以来，以第一作者或通信作者身份在国内外核心期刊发表论文60篇，其中SCI收录8篇。
【摘要】 华蟾素是传统中药，具有解毒、抗炎作用，对肝癌、肺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤具有抗癌作用，其机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、破坏细胞周期、逆转多药耐药等有关。近年华蟾素在治疗泌尿系肿瘤基础研究方面取得初步成功，现就其在泌尿系肿瘤中的治疗及相關机制进展作一综述。
【关键词】 华蟾素;泌尿系肿瘤;作用机理
中图分类号：R737 ? 文献标志码：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.11.002
【Abstract】 ? Bufalin is a traditional Chinese medicine with detoxification and anti-inflammatory functions. It has anticancer effect on many kinds of malignant tumors， such as liver cancer， lung cancer and pancreatic cancer， etc. Its mechanism may be related to inhibiting tumor cell proliferation， promoting cell apoptosis， destroying cell cycle and reversing multidrug resistance， etc. In recent years， bufalin has achieved initial success in the treatment of urinary tract tumors on basic research fields. This article reviews the progress of bufalin in the treatment of urinary tract tumors and related mechanisms.
【Key words】 bufalin; genitourinary tumors; mechanism of action
随着医学技术的发展，传统中医药材逐渐成为当今治疗肿瘤的重要手段及治疗策略，主要在于其不仅对肿瘤具有显著抑制作用，不易产生耐药性，而且对机体的损伤及副作用小。因此，研究中药材抗肿瘤效应具有广阔的临床应用价值。华蟾素是由中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺的分泌物提炼出来的一种生物活性多羟基类固醇，主要成分是蟾毒灵及吲哚生物碱等，属于地高辛类物质，是一种传统中药。华蟾素具有消炎、止痛、抗肿瘤等多种功效。近年研究表明，华蟾素对肝癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用并可诱导其凋亡[1～3]，其作用机制可能为抑制肿瘤相关信号通路如磷酸肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）、Wnt/β-catenin等[4～6]，从而影响肿瘤细胞的上皮间质变（EMT）、肿瘤细胞增殖、转移及诱导凋亡、破坏细胞周期、逆转细胞耐药性等多种恶性生物学行为[1～3]。近年，华蟾素在泌尿系肿瘤基础研究方面取得初步成功，本文现就华蟾素在泌尿系肿瘤中的治疗研究进展作一综述。
1 华蟾素治疗前列腺癌
前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤[7]，位居男性因癌死亡的第二位。前列腺癌患者接受雄激素剥除治疗（androgern deprivation therapy，ADT）可抑制前列腺癌进展，前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）下降，改善晚期或转移性患者总生存率（overall survival，OS）。但经过平均18个月的抗雄激素治疗，虽然血清睾酮的浓度维持在去势水平以下，但患者会从雄激素依赖性（androgen dependence，AD）转变为去势抵抗性前列腺癌（castration resistance prostate cancer，CRPC），表现为PSA上升，疾病进展如内脏及骨转移灶增多等，CRPC患者临床预后差，是目前治疗的难点。因此发现新型治疗药物对于提高CRPC患者预后十分重要[8]。
2003年有学者首次证实华蟾素可抑制雄激素依赖前列腺癌细胞LNCaP及雄激素非依赖DU145和PC3细胞增殖，促进细胞凋亡，细胞凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、caspase-9表达升高，细胞内Ca2+浓度增加，认为华蟾素促进细胞凋亡相关机制可能与华蟾素破坏细胞钙稳态和促进细胞凋亡相关酶表达增强有关，该研究的初步结果为华蟾素在泌尿系肿瘤中的应用揭开了序幕。2008年，YU等[9]研究也证实了华蟾素可抑制前列腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，可能与其上调Bax、细胞色素c、caspase等凋亡相关蛋白有关。研究发现华蟾素可延缓前列腺癌细胞LNCaP、DU-145和PC3细胞增殖时间，促进Bax、细胞色素c，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等凋亡相关蛋白等表达增强。在表达野生型P53基因的LNCaP细胞中，抑癌基因P53表达增强，反义TP53转染LNCaP细胞活力明显下降;而突变型P53的DU145和PC3细胞内Fas表达明显高于LNCaP细胞。小干扰RNA- Fas（small interfering RNA，siRNA）下调Fas表达后可提高肿瘤细胞活力。研究结果证实表达野生型P53的LNCaP细胞的上游诱导因子为P53和Fas，表达突变型P53的DU145和PC3上游诱导因子为Fas。
微小RNA（Micro RNAs，miRNAs）是一种内源性非编码长度为19～25核苷酸的小分子RNA，通过结合靶蛋白的3'-非翻译区（untranslational region，UTR），从而抑制靶蛋白翻译并诱导mRNA切割形成。研究证实在肿瘤的发生、发展过程中，miRNAs充当调节分子，起癌基因或抑癌作用[10～11]。miRNAs表达失调时可刺激细胞增殖和侵袭，增加肿瘤血管生成，从而促进肿瘤的发生及发展。2013年，ZHAI等[12]证实华蟾素抗肿瘤机制可能与调控miRNAs表达有关。他们发现华蟾素作用于前列腺癌PC3细胞后，可下调PC3细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达，促进细胞凋亡;实时定量PCR（qRT-PCR）发现华蟾素可诱导MiR-181a的表达增加，呈剂量依赖关系。而MiR-181a抑制剂可降低caspase-3表达水平，上调Bcl-2蛋白表达，降低PC3细胞凋亡。提示MiR-181a是一种抑癌分子，参与调控细胞凋亡相关因子。当华蟾素作用于前列腺癌细胞时，可使细胞内MiR-181a表达下调，进而抑制Bcl-2蛋白表达，促进凋亡相关蛋白caspase-3增加，导致细胞凋亡。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度大于200 bp，不编码蛋白质的RNA，已证实lncRNA在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用，它可通过海绵吸附相关的下游miRNA，影响其表达，称为内源竞争性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），从而影响miRNA调控靶基因的表达水平，进而实现其生物学功能。从ZHAI等[12]的研究结果得到启发，ZHANG等[13]使用lncRNA基因芯片检测经华蟾素预处理的前列腺癌细胞PC3细胞，与对照组相比，lncRNA HOTAIR在华蟾素预处理组的前列腺癌細胞中，表达显著下调。过表达lncRNA HOTAIR可逆转华蟾素对前列腺癌DU145和PC3细胞的抑制作用，进一步研究证实lncRNA HOTAIR与miR-520b存在竞争性结合作用，而miR-520b可抑制成纤维生长因子受体1表达（FGFR1）。他们认为华蟾素作用于前列腺癌细胞后，可下调lncRNA HOTAIR表达，从而导致miR-520b表达上调，抑制FGFR1表达后，导致前列腺癌细胞的迁移和侵袭力下降。ZHANG等[14]发现华蟾素可诱导前列腺癌LNCaP细胞发生caspase介导的细胞凋亡，同时，降低雄激素受体及PSA、类固醇受体共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）1、3蛋白表达水平;阻滞肿瘤细胞于G2期;诱导CYR61、CTGF衰老相关基因表达;增加P53及其下游细胞周期调控蛋白P21cip蛋白丰度，TP53-siRNA转染细胞后下调衰老相关半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase activity，SA-βgal）表达;还可降低细胞裸鼠肿瘤模型生长，治疗9周肿瘤重量较对照组降低67%（P<0.05），SA-βgal活性增强。研究结果提示华蟾素可能通过P53/P21cip信号轴诱导肿瘤细胞衰老，抑制细胞增殖。
以上研究证实华蟾素抑制前列腺癌恶性生物学行为的机制可能与促进细胞凋亡、抑制增殖、影响lncRNA和miRNAs表达、促进细胞衰老等有关，提示其有可能成为治疗晚期前列腺癌的新型药物。
2 华蟾素治疗膀胱癌
膀胱癌是泌尿系常见肿瘤，非肌层浸润性膀胱癌的标准治疗是经尿道膀胱肿瘤电切术+术后膀胱灌注，肌层浸润性膀胱癌的标准治疗是根治性膀胱肿瘤切除术。晚期或转移性膀胱癌临床预后差，无有效治疗方法。因此发现新型和有效治疗药物对于提高膀胱癌患者预后十分重要。
HONG等[15]探讨华蟾素对人膀胱癌T24细胞的影响，发现华蟾素可阻滞细胞于G2/M期;诱导凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9前体蛋白表达浓度显著增加;JC-1染色提示肿瘤细胞线粒体膜电位下降;抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL及凋亡抑制因子XIAP、cIAP-1和cIAP-2表达下调，Bax表达上调;诱导细胞表面跨膜受体Fas、死亡受体4（death receptor，DR4）、DR5和促凋亡配体TRAIL的mRNA及蛋白水平呈浓度依赖性增加。研究结果提示华蟾素抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡可能与激活线粒体介导的内源性凋亡途径和死亡受体介导的外源性凋亡途径有关。HUANG等[16]研究发现华蟾素作用于膀胱癌T24细胞后，可抑制细胞活力。DAPI/TUNEL双重染色检测提示细胞DNA凝集及凋亡增多，阻滞细胞于G0/G1期;上调抑癌基因Rb表达，下调细胞周期素D（cyclin D）、细胞周期素E（cyclin E）、细胞周期依赖激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2、CDK4及磷酸化Rb（p-Rb）的表达，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多导致产生细胞毒作用;降低线粒体膜电位水平，增加细胞中细胞色素c、凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）、凋亡蛋白酶活化因子1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）水平，促进caspase-3、caspase-7和caspase-9活化，激活线粒体依赖的凋亡通路诱导凋亡。Bufalin还可降低Akt活性及磷酸化Akt（p-Akt）和抗凋亡蛋白Bcl-2水平，增加Bax水平，提示通过改变Bax/Bcl-2比例和降低Akt活性可调控膀胱癌细胞凋亡。HUANG等[17]对华蟾素诱导膀胱癌T24细胞凋亡及其机制进行探讨。研究结果提示华蟾素通过下调Bcl-2表达，上调caspase-3表达，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡，可抑制Na+-K+-ATP酶α3亚基表达。而转染α3亚基过表达质粒使Na+-K+-ATP酶α3亚基过表达，明显减弱华蟾素抗肿瘤功能，导致肿瘤细胞凋亡减少作用。提示华蟾素促进膀胱癌细胞凋亡的机制可能与下调Na+-K+-ATP酶的表达有关。
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（收稿日期：2020-08-06 修回日期：2020-09-25）
（编辑：潘明志）
