MEBO对糖尿病大鼠慢性创面纤维细胞生长的影响

2022.08.04

李政麻华胆郑爱甜刘贤彬王琳曾娜吴标良

【摘要】?目的?体外观察湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment，MEBO）对糖尿病大鼠慢性创面纤维细胞生长的影响，探讨MEBO促进糖尿病慢性创面愈合的机制。方法?首先建立糖尿病创面大鼠模型，待第11天后分离、培养创面成纤维细胞，经消化、传代至第3代后，随机将细胞分成对照组、MEBO组（1 g/L），采用CCK-8法检测12、24、48、72、96 h细胞增殖情况，采用细胞划痕来观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响。结果?48 h起MEBO组各个时间点的OD值均高于对照组（P<0.05或0.001），细胞增殖率在72 h达到高峰;划痕实验检测显示，MEBO组促进成纤维细胞迁移能力比对照组强，差异有统计学意义（P<0.01）。结论?MEBO可促进糖尿病大鼠慢性创面成纤维细胞增殖与迁移能力。

【关键词】?MEBO;糖尿病;慢性创面;成纤维细胞;增殖

中图分类号：R587.2?文献标志码：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.01.003

【Abstract】?Objective?To observe the effect of moist exposed burn ointment （MEBO） on the growth of fibroblasts in chronic wounds of diabetic rats， and to explore the mechanism of MEBO in promoting the healing of diabetic chronic wounds. Methods?Firstly， the diabetic wound model was established in rats， after 11 days， the wound fibroblasts were separated and cultured. After digestion and passage to the third generation， the cells were randomly divided into control group and MEBO group （1 g/L）. And then， the CCK-8 method was used to detect cell proliferation at 12 h， 24 h， 48 h， 72 h， 96 h， and cell scratches were used to observe the effect of MEBO on fibroblast migration. Results?The OD value of the MEBO group at each time point was higher than that of the control group from 48 h （P < 0.05 or 0.001）， and the cell proliferation rate reached the peak at 72 h; scratch test showed that the ability of MEBO group to promote fibroblast migration was stronger than that of the control group， and difference was statistically significant （P < 0.01）.Conclusion?MEBO can promote the proliferation and migration of fibroblasts from chronic wounds of diabetic rats.

【Key words】?MEBO; diabetes; chronic wound; fibroblasts; proliferation

隨着人口老龄化以及生活方式的改善，糖尿病的患病人数在逐年增加，而糖尿病慢性创面愈合困难已成为糖尿病患者致残、致死的主要问题之一，创面愈合往往要经历凝血期、炎症期、增殖期、重塑期四个阶段，成纤维细胞生长在创面愈合中具有重要意义。湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment，MEBO）是一种在慢性创面领域应用超过30年的传统中医药，临床应用效果良好，但具体机制尚未阐明。本研究拟通过体外观察MEBO对成纤维细胞生长的影响，探讨MEBO促进糖尿病溃疡创面愈合的机制。

1?材料与方法

1.1?材料

1.1.1?动物

取自SPF级Wistar雄性大鼠的创面成纤维细胞，大鼠由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2014-0011。该实验经右江民族医学院动物伦理委员会批准。

1.1.2?主要试剂

链脲佐菌素（STZ）：北京华越洋生物科技有限公司生产;水合氯醛：成都市科龙化工试剂厂生产;胰蛋白酶、PBS液、二甲基亚砜（DMSO）：北京索莱宝公司生产;ExCELL南美胎牛血清：乌拉圭ExCELL公司生产;DMEM培养基：美国Gibco公司生产;CCK8：日本同仁公司生产;MEBO：汕头市美宝制药有限公司生产。

1.2?实验方法

1.2.1?造模

大鼠先给予高糖高脂饮食1月余，禁食16 h后采用腹腔注射STZ 40 mg/kg，1周后大鼠若出现多饮、多尿、体重减轻等一系列糖尿病症状且空腹血糖≥16.7 mmol/L，为糖尿病大鼠模型建立成功[1]，需隔日复测血糖，至少2次以上达标方为造模成功，糖尿病大鼠造模成功后，采用腹腔注射7%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉，大鼠麻醉成功后于背部备皮处理行约2.5 cm×2.5 cm大小的类圆形全层皮肤切除，即可完成糖尿病创面大鼠模型的建立，期间注意大鼠血糖情况，需每日定时皮下注射胰岛素控制血糖。

1.2.2?成纖维细胞分离、培养及分组

取糖尿病创面大鼠模型的第11天肉芽组织（糖尿病溃疡修复期），经盐水、PBS液清洗后进行胰酶消化，将消化分离出组织的原代成纤维细胞放置到37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养，需隔天进行换液，当培养瓶中细胞铺满整个瓶底的80%时再进行传代，第一次消化传代后的细胞视为P1代，待细胞传代至P3代时，胰酶消化细胞后平均分为2组（每组5个样本）：常规培养组（对照组）、MEBO组，MEBO为膏状药物，需先将其溶解到二甲基亚砜（DMSO）配成原液，再按一定比例加入到培养基中，浓度配成1 g/L使用。

1.2.3?CCK-8法检测细胞增殖

取对数期生长的成纤维细胞，以2×104/孔的密度接种于96孔板中，将其放置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱中培养24 h后，分为对照组、MEBO组，每组设5个复孔。分别培养12、24、48、72、96 h，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，放回细胞孵箱孵育1.5 h，用酶联免疫检测仪在450 nm波长检测各个孔吸光值（OD），并计算其各时间点增殖率：（A给药/A对照-1）×100%，实验重复3次。

1.2.4?观察MEBO对成纤维细胞迁移的影响

将成纤维细胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后，更换培养基，分为对照组、MEBO组，使用200 μL移液枪枪头直接在中部划直线，并做好标记以确定相对位置。然后于37℃、5%CO2培养箱中培养细胞，分别于0、24 h时测量并记录空白区，采用Image Pro Plus 6.0软件按以下公式计算细胞迁移率：（0 h空白区-24 h空白区）/0 h空白区×100%。

1.3?统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，符合正态分布数据以均数±标准差（±s）表示;两组比较采用两样本t检验;各时点间比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行检验。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2?结?果

2.1?MEBO对成纤维细胞增殖的影响

与对照组比较，MEBO组12 h、24 h的OD值虽高于对照组，但差异无统计学意义（P>0.05），而48 h、72 h、96 h均高于对照组，且差异有统计学意义（P0.05），MEBO组中的48 h与96 h间无统计学意义（P>0.05），MEBO组72 h与96 h间有统计学意义（P<0.001），72 h的增殖率为最高值。见表1。

2.2?MEBO对成纤维细胞迁移的影响

细胞迁移24 h时，对照组与MEBO组细胞迁移率分别为（19.27%±1.95%）、（33.91%±3.68%），MEBO组的迁移率高于对照组，差异有统计学意义（t=7.860，P<0.01）。见图1。

3?讨?论

2型糖尿病是由胰岛素抵抗引起的高血糖代谢紊乱疾病，其患病率、复发率及死亡率在我国仍逐渐上升[2～3]，但随着医疗条件及科技进步，糖尿病慢性创面导致的截肢率有所下降[4]，糖尿病慢性创面为糖尿病的常见并发症。因此，提高糖尿病慢性创面愈合率极为重要，但是目前我们对糖尿病慢性创面的病理和伤口的血管生成反应的了解并不全面，除了加强血糖控制以外，促进创面周围血管生成、改善血管微循环、高压氧疗、手术介入等治疗手段均有助于慢性创面的愈合[5]，因此，多学科治疗糖尿病慢性创面是目前中国现有医疗条件最理想的治疗模式。糖尿病足为糖尿病慢性创面最常见的一种疾病，有研究指出，在治疗难治性糖尿病足过程中，多模式循环加压局部伤口供氧家庭护理疗法优于一般标准护理疗法[6]。

纤维细胞为结缔组织中的一种细胞，在创面愈合的过程中，特别是增殖期，纤维细胞可转化为活跃的成纤维细胞。创面修复是一个复杂而又精细的过程，大致可分为凝血期、炎症期、增殖期和重塑期四个时期，其中包含了血小板、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角质细胞等[7]，而成纤维细胞的增殖和迁移能促进新生细胞外基质以及肉芽组织来达到创面修复[8～9]。TEPLICKI等人[10]发现民间常用于治疗皮肤轻微烧伤或者伤口的植物芦荟，可通过刺激成纤维细胞和角质细胞的增殖、迁移，从而达到加速创面愈合。

MEBO为目前烧伤或慢性创面治疗的一种常用药物，该药物通过湿润暴露、祛腐生肌、活血化瘀等传统的中医理念来使上皮组织、肌肉、神经组织快速修复达到治疗目的，缩短创面愈合时间。前期课题组已证明通过外用MEBO可使糖尿病大鼠创面中的成纤维细胞增殖，加速创面愈合。因此，本研究通过体外培养糖尿病大鼠成纤维细胞，在培养基中加入MEBO，观察细胞生长情况。从CCK-8实验可知，在不同的时间点加入MEBO的成纤维细胞数量增多，其增殖率也升高，特别是在48 h以后差异有统计学意义，在72 h达到最高，之后降低。在划痕实验中，含有MEBO的成纤维细胞的迁移能力比对照组强。

本实验的研究结果显示，MEBO可促进糖尿病大鼠慢性创面成纤维细胞增殖，且使细胞迁移能力增强，对加速糖尿病大鼠慢性创面的愈合起到重要作用，但目前影响成纤维细胞增殖的机制未能完全阐明，需进行下一步分子实验研究。

参?考?文?献

[1]?刘亚洋. Apelin-13对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤保护作用及相关机制的实验研究[D]. 北京：北京协和医学院，2019.

[2]?WANG L M， GAO P， ZHANG M， et al. Prevalence and ethnic pattern of diabetes and prediabetes in China in 2013[J]. JAMA， 2017， 317（24）： 2515-2523.

[3]?JIANG Y， WANG X， XIA L， et al. A cohort study of diabetic patients and diabetic foot ulceration patients in China[J]. Wound Repair Regen， 2015， 23（2）： 222-230.

[4]?XU Z R， RAN X W. Diabetic foot care in China：challenges and strategy[J]. Lancet Diabetes Endocrinol， 2016， 4（4）： 297-298.

[5]?OKONKWO U， DIPIETRO L. Diabetes and wound angiogenesis[J]. Int J Mol Sci， 2017， 18（7）： 1419.

[6]?FRYKBERG R G， FRANKS P J， EDMONDS M， et al. A Multinational， Multicenter， Randomized， Double-Blinded， Placebo-Controlled Trial to Evaluate the Efficacy of Cyclical Topical Wound Oxygen （TWO2） Therapy in the Treatment of Chronic Diabetic Foot Ulcers： The TWO2 Study[J]. Diabetes care， 2020， 43（3）： 616-624.

[7]?EMING S A， WYNN T A， MARTIN P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration[J]. Science，2017， 356（6342）：1026-1030.

[8]?DRISKELL R R， LICHTENBERGER B M， HOSTE E， et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair[J]. Nature， 2013， 504（7479）： 277-281.

[9]?LYNCH M D， WATT F M. Fibroblast heterogeneity：implications for human disease[J]. J Clin Invest， 2018，128（1）：26-35.

[10]?TEPLICKI E， MA Q L， CASTILLO D E， et al. The Effects of Aloe vera on Wound Healing in Cell Proliferation， Migration， and Viability[J]. Wounds， 2018， 30（9）： 263-268.

（收稿日期：2020-08-20?修回日期：2020-10-26）

（編辑：潘明志）