单细胞代谢物的质谱分析及其在单个神经元分析中的应用

    侯壮豪　詹柳娟　栾谋君　田双双　戴梦杰　黄光明

    

    

    

    摘?要?针对单细胞的代谢分析具有重要的研究价值，发展对单个神经元内的代谢物的分析技术（单个神经元分析技术）更是研究大脑的基础。由于代谢物分子种类众多，浓度差异巨大，目前单细胞代谢分析方法主要是基于质谱技术发展起来的。利用质谱从单个神经元层面对代谢物开展研究，有助于揭示神经元的异质性，为探索神经元工作机制、研究神经元代谢活动以及针对重大脑疾病开发新疗法提供新的研究工具。本文对近年来对单细胞代谢物的质谱分析新方法进行了系统评述，从离体培养的神经元、新鲜分离的神经元和组织原位的神经元等方面介绍了单细胞质谱分析技术在单个神经元分析中的应用，并从质谱仪器技术的开发、新分析方法的发展和生物研究应用3个方面对单个神经元的质谱代谢分析的发展前景进行了展望。

    关键词?单个神经元分析; 代谢物分析; 单细胞质谱; 评述

    1?引 言

    细胞是生命活动的基本单元，分析和检测细胞生命过程中各种化学物质的变化，可以为药物开发、病理探讨、细胞毒性等重大生物医学问题提供理论指导，具有重要的科学价值。作为神经系统的基本单元，神经元的研究技术（尤其是单个神经元分析技术）是研究大脑的基础。神经元内的小分子代谢物是神经元正常工作的基础，可介导神经信号的传递，或对中枢神经网络进行调控，具有非常重要的生理功能。由于细胞异质性，不同的代谢物质在不同类型的神经元内的分布和功能均不相同; 在不同类型的神经元中，同一种化学物质的含量也并不相同，产生的生理作用也大相径庭。目前，由于相关技术的种种局限，对于这些相关内容的研究大多得到多个细胞的平均信号，对于单个神经元（Single neuron）内的化学物质基础的了解仅限于某几种特殊化合物，对于单个活体神经元的研究则更加有限。

    单个神经元质谱分析的主要技术难点在于：细胞内物质种类多，浓度分布跨度大，且存在大量无机盐干扰; 单细胞体积小，细胞仅有皮升级的体积，常规质谱仪器以及分析方法均无法胜任。种种困难限制了对单个神经元的深入研究，单个神经元的代谢分析无论从相关分析技术的发展还是研究价值都长期被低估。

    近年来，基于各种放大技术的单细胞基因组及转录组的研究得到了飞速发展，神经元细胞的个体差异要远超过之前的认知，单细胞的分析技术为单个神经元生命活动研究开辟了新的途径，有望为重大生物医学问题提供新的解决方法与思路，为探索人类神经元工作机制，以及针对重大脑疾病开发新疗法提供新的研究工具。

    近年来，单细胞尤其是单个神经元内代谢物的研究方法得到了越来越多的重视，出现了一系列开拓性的研究工作。本文对近二十年来相关研究进行了总结，着重评述单细胞代谢质谱新技术在单个神经元内代谢物分析中的应用与发展。

    2?早期胚胎单细胞的质谱代谢分析

    受精卵（Zygote）与早期胚胎（Embryos）中单细胞体积大，是众多单细胞分析方法重要的研究模型之一。受精卵与早期胚胎在生命体系中扮演着重要角色，其发育与分化过程中伴随着许多物质的快速新陈代谢，细胞间存在十分显著的异质性（Heterogeneity）。对受精卵与早期胚胎的单细胞层面的研究，有助于揭示细胞个体在发育分化的分子调控机制，具有重要的生物学研究价值。很多研究常采用受精卵与早期胚胎作为初始模型发展相关技术，再将新技术进一步借鉴、拓展和延伸到细胞体积更小的单细胞模型，尤其是单个神经元的分析。

    毛细管电泳?电喷雾质谱法（Capillary electrophoresis?electrospray ionization mass spectrometry，CE?ESIMS）具有上样量小，灵敏度高等特点，适合对微量样品进行快速的分离分析，Nemes研究组针对蛙卵细胞开发早期胚胎单细胞微区取样分析方法[1～5]，对8?细胞期[3，4]和16?细胞期[2]胚胎中不同种类的胚胎单细胞进行代谢物异质性研究，发现小分子代谢会对细胞亚型的发育产生重要的影响，部分物质如Asparagine， Glycine和Betaine在不同细胞间存在显著性差异，并利用单细胞中测得的氨基酸等70多种代谢物的信号强度、保留时间等信息实现了8?细胞期胚胎中腹部和背部细胞亚型的主成分分析（Principal component analysis，PCA）分型。

    光电离质谱技术由于其使用的激光光斑较小，有利于进行单细胞分析。利用激光剥蚀辅助的电喷雾（Laser ablation electrospray ionization， LAESI）[6，7]、基质辅助激光解吸附电喷雾（Matrix?assisted laser desorption/ionization electrospray， MALDI）[8]和真空紫外光电离（Vacuum ultraviolet laser desorption/ionization，VUVDI）[9]能够高效地实现受精卵早期胚胎的代谢物及磷脂成像分析[6，7，9]和三维成像[8]。

    此外，解吸附电喷雾质谱（Desorption electrospray ionization mass spectrometry，DESI）也被用于研究卵母細胞[10]和胚胎单细胞[11]的代谢及其细胞亚型的分型。

    3?培养单细胞的质谱代谢分析

    对组织中的特定细胞分离后进行原代培养或传代，通过培养液模拟生物环境，可以使细胞功能和进程的研究更具可操作性。培养的细胞易于施用物理、化学和生物手段进行细胞干预，便于与现有的分析技术结合，在细胞学、遗传学、免疫学、实验医学等方面的研究中都发挥着重要的作用。对单个神经元进行体外培养与质谱单细胞代谢分析，可以有针对性地研究神经元内物质的变化、神经递质的传递，进而研究神经元功能的分子作用机制，为神经元的疾病诊治提供研究基础。

    目前， 针对体外培养的细胞（Cultured cells）已发展出了许多高效的单细胞代谢技术，其分析技术对单个神经元的研究也起着重要的启示作用。

    3.1?电喷雾离子化质谱

    为了实现单细胞微量胞浆的分析，Masujima研究组采取毛细管取样后，在喷针后端补充溶剂的方式，实现单细胞的代谢物检测[12]，并将真皮细胞中肥大细胞的胞浆和颗粒、实验溶剂、培养基的质谱谱图直接导入数据处理软件，利用主成分分析能够有效地将溶剂、培养基的谱图与肥大细胞的数据区分（图1A） [13]，并使用毛细管针对单细胞取样后施加超声波， 实现单细胞内代谢物的快速释放与萃取[14]。此外，为了进一步研究单细胞的亚结构，他们对HepG2细胞不同细胞期进行微区取样[13]，实现微区代谢物的检测。Vertes研究组利用毛细管取样针对贴壁的HepG2进行取样与离子化，结合离子迁移谱过滤干扰信号，研究HepG2细胞内能量转换、氧化还原和代谢转化的代谢物[15]，采用正交校正的偏最小二乘分析（Orthogonal partial least squares?discriminant analysis， OPLS?DA）对数据进行细胞周期的分型（图1B）[16]。而Hui研究组对单细胞中亚结构的脂滴取样，进行甘油三酸酯（Triglycerides，TG）和磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholines，PC）的萃取离子化，发现不同处理条件下TG和PC的成分会发生显著的变化[17]。

    Zhang研究组将单细胞分散于微孔板中，加入萃取剂实现单细胞中代谢物的萃取，利用纳升电喷雾质谱对细胞内磷酸化葡萄糖进行定量分析[18]; 为了提高单细胞分析的通量，该研究组提出了流式电喷雾技术（Flow cytometry ESI?MS， CyESI?MS， 图2A）[19]，实现细胞的高通量分析，并利用t分布随机邻域嵌入分析（T?distributed stochastic neighbor embedding，t?sne）实现单细胞亚型的分型。为了进一步去除基质干扰，提高信号灵敏度，液滴微萃取[20，21]、微孔阵列萃取[22]、多级微萃取[23]和毛细管电泳等电聚焦[24]等技术被开发并应用于单细胞基质清除与代谢物富集，提高分析灵敏度，同时实现高通量单细胞分析[20～22]及单细胞亚型的分型[23]。

    Lin研究组开发了基于微流控的喷墨打印技术（Drop?on?demand inkjet printing，图2B）[25]和迪恩流有序化单细胞分离技术（Dean flow assisted cell ordering system）[26]，实现悬浮细胞的单细胞分离与进样，与电喷雾结合实现单细胞内代谢物的检测，并对细胞的脂质进行PCA分析，实现多种细胞的分型。

    Yang研究组发展了一种用双通道毛细管取样针进行原位微区物质萃取与离子化的单探针?电喷雾技术（Single?probe ESI，图3A），能够实现悬浮HeLa单细胞[27，30，31]、藻类单细胞[32]等的代谢物及磷脂类物质的分析检测。该研究组将这种高效的技术成功运用到细胞肿瘤干细胞的药物研究，发现肿瘤干细胞不饱和脂肪酸的水平要比非癌症干细胞的水平高，且抑制细胞内一些相关酶的活性能够有效降低不饱和脂肪酸的含量，能防止形成肿瘤球体[33]。结合在线衍生的方式[34]，实现对HeLa单细胞内代谢物的化学衍生，转换成容易离子化的形式，进一步提高细胞内代谢物的检测种类。此外，该研究组对数据进行深入研究与挖掘，利用机器学习、主成分分析等对白血病单细胞[35]进行细胞分型以及耐药性癌细胞表型预测[36，37]。

    3.2?二次离子质谱

    Sheng等[28]采用15N标记的氨基酸培养细胞， 并利用二次离子质谱（Secondary ion mass spectrometry，SIMS）对蛋白进行分析（图3B），利用蛋白质的特征碎片，实现15N氨基酸在体内的转化定位。为了提高SIMS分析灵敏度，Long研究组将金属纳米层[38]、石墨烯量子点[39]作为新的基质，实现单细胞脂质体高灵敏度成像分析，并研究了银纳米粒子的摄入对细胞表面脂质的影响（图3C）[29]。

    3.3?激光解吸附离子化质谱

    Vertes研究组用LAESI 对HepG2贴壁细胞与悬浮细胞进行代谢物分析，发现贴壁细胞腺苷酸能荷值远高于悬浮细胞（图4A）[40]; 该研究组还对光电离（LDI）开发了新型的纳米阵列基质，提高激光解离的光离子化效率，成功提高了酵母细胞内代谢物的分析能力[41，42]。Wang等[43]开发了VUVDI， 实现了单细胞内弱极性代谢物的软电离亚微米成像。 Hang研究组则开发了近场解吸附质谱实现了贴壁单细胞的形貌及代谢物的分布的同时分析[44]，以及飞秒激光离子化技术实现了细胞内元素分析[45]。

    将培养的细胞分散于MALDI的样品板上，结合微区分析技术，能够很便捷地实现单细胞中代谢物的分析[47～49]。為了提高单细胞代谢分析的通量，Zenobi研究组发展了高密度微阵列芯片?MALDI技术（图4B）对绿藻单细胞[46，50]、酵母单细胞[51]和HeLa单细胞[52]进行代谢物分析，侧重研究单细胞内能量转换相关的代谢物（ATP/ADP）及其转换过程。为了对细胞进行多维度的分析，获得单细胞的多层次信息，该研究组在MALDI与光谱学方法联用技术上进行了开拓，发展了拉曼和荧光与高密度微阵列MALDI质谱?联用[53]和光学?拉曼?荧光?MALDI联用[54]对绿藻单细胞生长状况进行多维度监测。

    与普通的单细胞模型如HeLa，HepG2等细胞不同，神经元除了有较大的胞体外，还存在直径小于1 μm的突触结构，为了研究体外培养神经元（Cultured neurons）及亚结构，须开发分辨率、取样精度更高的方法，以实现神经元的微区分析。Sweedler研究组利用 SIMS实現培养的单个神经元亚结构内代谢物的成像分析[55]。将MALDI与免疫组化[56]、SIMS[57]等技术结合，可以实现培养单个神经元内脂质和低丰度的代谢物的分析。

    Xu等[58]组利用电化学泵产生电渗流，用130 nm的毛细管针作为取样针与喷针，实现对培养神经元细胞的轴突和树突的代谢物分析，发现谷氨酸和焦谷氨酸在轴突处的浓度要高于胞体和树突。

    4?新鲜分离单细胞的质谱代谢分析

    细胞培养能够在一定程度上模拟体内环境，使细胞生存、生长， 并维持主要的结构与功能，但是由于其存在环境与真实体内环境存在一些差异，细胞离体后部分功能与活性会受到抑制甚至消失。因此， 对培养的细胞获得的一些实验结果并不一定能真实地反映体内的情况。

    神经元虽然能够在体外培养中存活与生长，但Nemes等[59]利用毛细管电泳对新鲜分离的神经元与培养的神经元内代谢物进行分析，发现培养环境不同，部分类型的神经元细胞内代谢物改变较大。尽可能地接近真实细胞的存在状态，才最能反映细胞内实际的代谢状况。因此针对新鲜分离的单个神经元（Freshly isolated single neuron）进行代谢物分析，才能更为真实地反映单细胞内的代谢物分布情况。

    Passarelli等[60]利用C61SIMS对海蜗牛神经元内脂质进行表征与成像，发现在神经元表面脂质的分布存在异质性。此外，Zhang等[61]结合离子迁移谱IMS?ESI，利用多肽与代谢物在离子迁移谱的漂移时间差异，提高神经肽信号的分析灵敏度，实现离体单个神经元中神经肽的分析。

    Sweedler的研究组利用毛细管电泳?电喷雾质谱联用技术，分析了海蜗牛离体神经元[62，63]及其亚结构[64]中的代谢物，并根据代谢物的差异，用PCA实现神经元亚型的分型（图5A）[62]。他们尝试将多种神经元分散于MALDI基板上，喷涂基质后对其进行分析，能够同时检测神经元中的代谢物，并利用PCA实现了稀有细胞脑垂体细胞、胰岛细胞和神经元细胞的分型[65]。该研究组实现了对海蜗牛离体神经元[66]和离体大鼠神经元[67]寡肽的分析。该研究组利用MALDI大规模分析了30000个神经元内脂质的信号（图5B），并运用t?sne实现不同亚型的细胞的分型[68]。

    此外， Jarecki等[69]利用MALDI也实现了离体单个神经元内神经肽的发现及定位; Li研究组将Microcolumn LC与MALDI结合实现离体单个神经元的寡肽分离与定性分析[70，71]; Neupert等[72]利用 MALDI对组织美洲大蠊单个神经元实现了一些寡肽的分析。

    5?原位组织上单细胞的质谱代谢分析

    细胞一旦离开组织环境，细胞营养的供给方式、细胞间的接触交流都会发生巨大改变，并且会伴随着很大程度的细胞生理应激。特别是单个神经元与神经元细胞之间通过突触相连，离体之后无法进行重要的神经活动，也就无法完整地获得细胞的真实状态。因此，为了真实地反映神经元的状态，在组织上直接原位分析单细胞代谢显得尤为重要。

    Masujima研究组采用毛细管喷针直接对植物叶片[73，74]、花瓣[75]等单细胞取样后进行ESI分析，能够原位获得植物单细胞中代谢物信息。Nonami的研究组利用电喷雾技术对[76，77]植物叶片进行了原位单细胞分析。Vertes研究组利用LAESI技术针对植物组织细胞如洋葱细胞[78～81]、叶片[82，83]等进行了单细胞及其亚细胞器分析，并利用Post hoc grouping、OPLS?DA等数据处理方法，对细胞进行分型，发现许多代谢物的丰度在不同细胞群体内分布不一样。 Zhao等[84]采用氢火焰离子化质谱对植物叶子单细胞取样并实现细胞内代谢物的检测。 Zhang的研究组利用固相微萃取[85]、衍生[86]的方式针对性地提高植物细胞及其亚细胞器中特定代谢物（如糖类）的分析灵敏度。

    Merrill等[87]用膜片钳原位监测单个神经元，取样后用Nanoflow LC进行脂质的分析，鉴定出40余种脂质，并且对不同刺激条件下的神经细胞进行PCA分型; Neupert等[88]结合膜片钳?MALDI实现原位美洲大蠊单个神经元内电生理信号与代谢物的成像。

    Aerts等[89]采用膜片钳与毛细管电泳质谱结合的方式（Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis?mass spectrometry）实现了原位活体单个神经元的生理信号及代谢物的同时分析（图6）。通过对γ?氨基丁酸能神经元（Gamma?aminobutyri acid?ergic neurons）和谷氨酸能神经元（Glutamatergic neurons）的研究，在谷氨酸能神经元的胞浆中检测到60种代谢物，但没有出现GABA，而在单个γ?氨基丁酸能神经元的胞浆中能够测到GABA的信号，进一步证实脑区中神经元的异质性。这种方法能够很好地实现单个神经元的神经化学状态与细胞生理活性的同时关联监测。

    Huang研究组和Xiong研究组合作，通过单细胞膜片钳和纳升电喷雾喷针对单细胞内液进行采样; 利用感应电喷雾特殊的离子化过程[92～94]，对体系较复杂的神经元中的神经递质进行原位分离与检测，检测出50余种代谢物（图7A）， 从单细胞层次，比较了不同脑区神经元之间的组分区别，观察到了在年龄、变异等生理过程中细胞质组分的变化，并用于研究单个神经元中物质的代谢途径[90]。他们利用原位质谱技术对神经元中的其它代谢路径进行了研究，发现了一些在细胞匀浆体系中尚未检测到的代谢路径（图7B）[91]。结合动物行为学试验，揭示了紫外线调控学习认知功能的分子机制。以上发现是对常规分析方法的结果的重要补充，揭示了活体单细胞原位质谱分析可从单细胞层次对一些生命科学中的重大科学问题进行再次深入的阐释。

    6?展 望

    單个神经元内代谢物的质谱分析在过去的十余年里取得了长足的进步，但目前将质谱分析应用于单个神经元的代谢研究仍存在诸多局限，还需要从仪器改造、分析方法以及应用研究多个方面展开深入研究。

    由于神经元内物质种类众多，浓度分布跨度大，且存在大量的无机盐成分干扰，需要从根本上提高质谱仪器的绝对灵敏度。比如借助多级离子累积技术[95]，有望将被稀释的代谢物重新富集出来，在质谱中获得响应，实现单个神经元中低丰度物质的检测分析。另外，将质谱与离子迁移谱[16，63]等快速分离的技术耦合，也有望进一步降低质谱检测中化学噪音的干扰，提高代谢物在质谱中的信噪比。此外，对单个神经元内目前难以检测的弱极性和非极性物质，需要通过质谱离子源的开发，例如结合光电离[96]、质谱光解离[97，98]、分子?离子反应[99，100]等技术，提高单个神经元层次的分析灵敏度。

    单细胞/单个神经元分析最终的研究目标是研究其生物功能，因而开发生物兼容更好（获得单个细胞更加接近组织环境的信息）的分析技术显得尤为重要。目前的单个神经元分析常需要进行毛细管电泳等分离操作，导致单个神经元的分析通量受到极大的限制。因此联合自动化操作技术，或者借鉴流式细胞仪质谱的思路[19，101～106]，降低单个细胞的质谱分析时间，才有望提高单个神经元分析的通量，为单个神经元的异质性研究提供更加丰富的数据。此外，对于质谱信号极差的低丰度的物质，可以通过细胞环境原位衍生等方法将代谢物转化成容易离子化的信号[86，107]，有望进一步扩展单个神经元在质谱分析中的代谢物覆盖度。

    “脑计划”目前是世界生物医学的重大课题之一，是继人类基因组计划之后另一个宏伟的科学研究计划，研究大脑基本单元?神经元的技术（单个神经元分析技术）是研究大脑的基础。针对单个神经元的代谢分析技术， 研究者已经积累了许多高效的技术手段和工具，但绝大多数的研究仍集中在离体的单个神经元的质谱新技术开发上，针对组织上单个神经元的原位分析技术也存在影响细胞活性的问题。针对单个神经元进行原位无损的代谢物分析，对质谱学研究也提出了极大的挑战。只有实现单个神经元的无损原位分析，才能与记录脑活动的电化学检测方法耦联，实现在微观/时间分辨层面开展长程神经环路的结构、认知过程中神经递质的动态变化和信息处理机制、以及环路结构和功能可塑性的研究。

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    Metabolites Analysis of Single Cell by Mass Spectrometry

    and Application in Single Neuron Metabolites Analysis

    HOU Zhuang?Hao， ZHAN Liu?Juan， LUAN Mou?Jun， TIAN Shuang?Shuang，

    DAI Meng?Jie， HUANG Guang?Ming*

    （Department of Chemistry， School of Chemistry and Materials Science，

    University of Science and Technology of China， Hefei 230026， China）

    Abstract?Single?cell assays has emerged as a cutting?edge technique during the past decade. Despite several issues （including pL volume， extremely complicated intracellular fluid and maintaining cell viability during sampling） still need to be addressed， single?cell mass spectrometry for metabolites has achieved remarkable results recently. Various mass spectrometry?based approaches have enabled identification of vast cytoplasmic chemical constituents at single cell level， which greatly facilitate the single neuron analysis at different physiological conditions. In this review， we have concluded recent single?cell mass spectrometry investigations toward single neuron analysis， including single ovum/zygote， single cultured cell， single freshly isolated cell and single cell/neuron on tissue.

    Keywords?Single neuron analysis; Metabolites analysis; Single cell mass spectrometry; Review