阿尔茨海默症脑组织基质辅助激光解吸电离质谱成像分析研究新进展

    张阳阳　韩超　赵镇文

    

    

    

    摘?要?阿爾兹海默症（Alzheimer's disease， AD）是影响全球数百万人并与年龄有关的神经退行性疾病，但确切病因仍不清楚。基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）分析技术不仅可进行物质鉴定，而且可对被分析物进行空间分布成像，近年来广泛应用于AD脑组织中淀粉样蛋白和脂质的分布研究，以探索该疾病的机理。本文介绍了基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）的原理、方法学以及在AD疾病机制方面的相关研究进展，并对其发展前景进行了展望。

    关键词?阿尔兹海默症; 基质辅助激光解吸电离质谱成像; 评述

    1?引 言

    阿尔兹海默症（Alzheimer's disease， AD）是一种神经退行性疾病， 以中年和老年人的认知能力下降为主要特征。随着全球老龄化进程加快，AD发病率近年来不断增加。据2010年AD发病统计，全球大约3560万人患有AD，据估计到2050年，全球AD发病人数将高达1.15亿[1]。

    AD类型多样，具有散发型和家族型两种形式。绝大多数患者属于散发型或迟发性痴呆的家族型（晚于65岁），其余少数患者属于早发性痴呆的家族型（大约30～65岁），并且表现出不同的症状。家族型患者在编码β?淀粉样蛋白（β?amyloid， Aβ）的淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）、早老素1和2（Presenilin， PSEN1/2）3种基因之一时具有突变：其中早老素分泌酶复合体催化亚基的组分，负责APP的切割和Aβ的形成。散发型AD的起源复杂，涉及多种遗传和环境影响因素，如携带载脂蛋白的E?ε4等位基因、线粒体功能障碍、头部损伤或脑血液屏障受损等[2]。

    尽管AD是老年痴呆最常见的形式，并影响全球数百万人，但这种疾病的确切病因仍不清楚。罕见的AD家族型遗传学证据证明了Aβ斑块积聚是疾病起源的假说，这是淀粉样蛋白β级联假说的基础，是过去三十余年AD研究的中心理论[3]。根据该假设，最开始是Aβ沉积，这足以触发AD病理和临床变化的级联反应，即老年斑和神经原纤维缠结形成，以及随后的神经元死亡、血管损伤和痴呆症状。Aβ肽包含约40个氨基酸，并由APP通过β?和γ?分泌酶产生。虽然Aβ1?42在老年斑中占优势，但其它Aβ变体（包括N末端或C末端修饰的Aβ）也存在于AD患者脑组织中。单个Aβ肽在老年人以及AD患者脑组织中的分布目前尚未完全清楚。因此，对AD患者脑组织中重要物质的差异性分布实现原位成像，将有利于AD病理机制的研究。

    质谱成像技术能够精确、快速识别具有不同表达水平的特定蛋白质的细胞，能够确定患病器官和正常器官中不同部位（包括肿瘤部位）的特定蛋白质的位置及相对浓度，能够跟踪包括癌症在内的多种疾病的治疗药物及其代谢产物的空间分布，因而在了解组织病理特征、疾病诊断、药物疗效及发现生物标志物等方面可能成为一种强有力的全新研究工具[4～9]。此外，通过比较正常与疾病组织的物质分布，质谱成像技术可在肿瘤早期诊断、预后评估等临床应用中扮演重要角色。本文概述了基质辅助激光解吸电离质谱成像的原理、方法学，以及该技术在阿尔茨海默病脑组织中成像等方面的研究进展。

    2?基质辅助激光解吸电离质谱成像原理及方法

    基质辅助激光解吸电离质谱成像（Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging，MALDI MSI）技术最早由Caprioli等[10]于1997年提出，通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比（m/z）化合物的二维离子密度图（Two?dimensional ion density maps），对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析[11，12]（图1）。相较于LC?MS方法，MALDI MSI无需对样品进行萃取、纯化、分离等复杂的前处理，并且保留了物质的原位信息，这些特点使得MALDI MSI分析方法在生物标志物的识别、代谢机理的研究、刑事科学及食品科学等领域均有着广泛的应用前景。

    2.1?MALDI MSI原理

    基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）是20世纪80年代末由Karas和Hillenkamp引入的一种软电离质谱技术， 能够快速分析高分子量的物质， 无碎片或只有少量碎片， 具有很高的检测精度和灵敏度， 是一种重要的高通量的生物分析工具[13]。它的工作原理是：当用一定强度的激光（355 nm）照射样品与基质形成的共结晶薄膜时， 基质从激光中吸收能量，提供卷流， 将样品分子送入气相， 样品分子得到基质提供的电荷或反应离子从而发生电离， 根据不同的质荷比（m/z）进行检测可得到样品的分子量。

    MALDI MSI是在专门的质谱成像软件控制下完成的。首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵（如6000个点/100 μm），激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件开始采集质谱数据[14]。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。设定m/z的范围，并选定峰高或峰面积代表化合物的相对丰度，计算机虚拟扫描质谱数据，便可形成该组织切片的二维离子密度图像，并用亮度强弱（黑白成像）或不同彩色图案（彩色成像）代表丰度[4，15]。

    2.2?组织切片技术

    为了获得最佳效果的图像，组织切片的优劣是关键的影响因素。切片制备需要满足以下条件：防止形成冰晶，维持化合物的空间排布，避免分析物的移位和降解;避免切片打卷、起皱褶;适宜的切片厚度。在组织切片前，切除的新鲜组织立即置于液氮中冷冻2～3 min后，转移至80℃保存直至使用。使用液氮迅速降温可通过最大冰晶生成带，从而有效减少冰晶的形成。切割平台的温度根据组织类型保持在5～25℃之间，如高脂肪含量的组织就要求更低的温度[16]。冰冻样品保存或进行冰切时，还应尽量避免温度波动（特别是18℃以上的温度波动，避免发生重结晶;冰切过程中，若样品含水量较高，则尽量避免冰切温度高于18℃）。切片厚度一般为10 μm，保证质谱分析时足够的组分浓度[17～19]。在进行样品制备、质谱分析时，建立稳定的实验过程和良好的对照是必要的，从而保证获得可比较的空间图像。

    2.3?基质的选择和喷涂方式

    基质的选择是MALDI质谱实验成功的关键，在实验中选择何种基质进行样品分析依赖于所分析的样品（如样品的种类、质量大小及性质等），选择合适的基质体系对于直接组织分析，获得高质量、高灵敏的图谱尤为关键。需要满足的基本条件包括：基质可与组织表面分子形成良好的共结晶;能提供目标分子的高效离子化能力。以蛋白质等大分子为分析对象时，常用Sinapinic acid （3，5?dimethoxy?4?hydroxycinnamic acid， SA）作为基质，而在分析多肽类小分子时，常用a?Cyano?4?hydroxycinnamic acid（CHCA），针对组织表面的药物小分子或代谢小分子等的分析，也有研究者选用2，5?二羟基苯乙酮（2，5?Dihydroxyacetophenone， DHA）[20～23]、9?氨基吖啶（9?Aminoacridine，9?AA） [24～28]、1，5?萘乙二胺（1，5?Diaminonapthalene， DAN）[29]、2，5?二羟基苯甲酸（2，5?Dihydroxybenzoic acid，DHB）[30，31]、2?巯基苯并噻唑（2?Mercaptobenzothiazole，2?MBT）[32]、蒽三酚（Dithranol， DT）[33]和槲皮素（Quercetin）[34]等作为基质。Wang等[35]研究发现，羟基黄酮类化合物可作为基质进行MALDI MSI分析，在正离子模式下，该类物质对磷脂类小分子具有很好的解析能力，其中1种化合物槲皮素可从鼠脑组织组织切片中解析到212种脂质，显著优于常用的有机小分子基质DHB、CHCA和MBT等，并且该类物质还具有易于形成均匀结晶薄层、真空条件下稳定、自身信号低、用量少等优点;Nie课题组[36～40]近年来在研究中发现，萘的衍生物二氨基萘及其盐酸盐和N?（1?萘基）乙二胺及其盐酸盐或硝酸盐作为基质在负离子模式下对小分子化合物具有很好的解析能力。此外，对基质体系进行优化可改善结晶状况，使样品有效解吸电离，增强质谱信号，进而提高分析灵敏度、分辨率和重复性等。如Schwartz等[41]对基质体系的溶剂进行考察，以SA为基质，改变基质溶剂，使其中的有机溶剂分别为30%、50%和70%时，发现当溶剂中含50%有机相时，组织表面的结晶更加均匀;同样以SA为基质，改变有机溶剂的组成，如乙醇、甲醇、乙腈等，发现当有机相为乙醇时，可得到更均匀的结晶和更强的信号。另外，考察基质体系中三氟乙酸（TFA）的浓度发现，TFA的含量在0.3%～1.0%之间，较有利于组织表面分子的离子化。相对于有机小分子基质， 无机纳米材料基质本身不易电离，近年来越来越多的无机纳米材料如硅材料、碳材料以及金属材料等被用于小分子化合物的MALDI MSI分析。二氧化钛纳米颗粒 （TiO2NPs）具有对紫外光强吸收的特点，Shrivas等[42]以其为基质，结果显示，正离子模式下，TiO2NPs对于低分子量区域（<500 Da）的物质具有非常强的解析能力。 Wu等[5]利用多巴胺包被TiO2，大大提高了TiO2的基质性能，使得部分化合物的检测限降低了10～30倍。使用这种新方法，超过100种分子（包括氨基酸、生物碱、游离脂肪酸、肽和脂质）得到了很好的质谱成像结果。Horatz等[43]发现共轭聚合物具有优异的基质性能，并且可实现溶液加工，涂覆成薄膜，从而大大减少了基质的用量，解决了基质喷涂不均一的问题，且该类聚合物在正负离子模式下都显示出非常好的電离能力。另外，Chen等[44]研究发现，碳纳米管作为基质在负离子检测模式下对于小分子物质（如脂肪酸、氨基酸、多肽等）具有很强的解析能力，对于硬脂酸的检出限可达到0.2 fmol。虽然无机纳米材料基质表现出优于传统有机小分子基质的诸多特性，但无机纳米材料的性质与其制备方法、尺寸等密切相关，因此在使用该类材料作为基质时必须考虑重复性的问题。总体而言， 基质的选择和优化都需要根据分析的组织和目标分子进行优化和选择。

    目前，常用的基质喷涂方式按机理的不同主要有三类：喷枪法、升华法、自动喷雾法。其中，喷枪法是操作最为简单、效率最高的基质喷涂方式，但是受人为操作因素影响较大，重复性差;升华法可制备均匀的基质结晶薄层，但要求基质在真空条件下具有一定的挥发性; 自动喷雾法是目前应用最广泛、发展最活跃的一种基质喷涂方式，相较于前两种方式，具有基质结晶较为均匀、自动化程度高、适应性强等优点，几乎所有的基质都可使用该种方法并可获得比较理想的喷涂效果，也是商业化的基质喷涂装置常用的喷涂方式。Gemperline等[45]的研究表明，在MALDI MSI分析中，自动喷雾法制备样品的成像分辨率和重现性均优于喷枪法，升华法是其中成像分辨率最高和重现性最好的基质喷涂方法，但检测到脂质的种类最少;Guo等[46]的研究表明，在负离子模式下，利用高压电喷雾的方法进行NEDC（N?（1?萘基）乙二胺盐酸盐）喷涂，能够显著增强对小分子代谢物质（如脂肪酸、核苷类物质等）的检测灵敏度。Li等[12]利用自制高压电喷雾的新型装置可有效控制基质的晶型，用于9?AA、CHCA、MBT及无机纳米材料TiO2NPs等的喷涂，进行鼠脑组织中脂质成像时可获得较高的分辨率和清晰度（图2）。

    3?MALDI MSI在阿尔茨海默病脑组织中成像的应用

    近年来，MALDI MSI被广泛用于阿尔茨海默病脑组织成像，研究内容包括AD小鼠模型中淀粉样蛋白Aβ的分布、AD小鼠模型中脂质的分布、人类AD患者脑组织中淀粉样蛋白Aβ和脂质的分布。

    3.1?AD小鼠模型中Aβ的分布

    MALDI MSI对AD有贡献的研究最初由Stoeckli等[47]建立，采用新鲜冷冻APP23转基因小鼠的大脑组织切片，这是一种经常使用的基于人淀粉样前体蛋白（APP）过表达而表现出瑞典型突变的AD模型[48，49]。APP23转基因小鼠显示，6个月后，在皮质和海马中出现第一个淀粉样蛋白的沉积物[49];此外，过度磷酸化的tau蛋白仅位于嗜刚性的斑块中。因此，这种小鼠模型是理想的研究过表达Aβ的AD模型的候选模型。此外，使用芥子酸作为基质，适于MALDI质谱鉴定对应于Aβ的m/z。将Aβ（1?37， 1?38， 1?39， 1?40和1?42）的MALDI MSI与用NT11抗血清进行免疫染色的切片比较，Aβ1?40和免疫染色信号的特征可在空间上合理匹配，证明了淀粉样蛋白Aβ1?40的残留[50]。

    3.2?AD小鼠模型中脂质的分布

    Hong等[51]进一步研究了5XFAD小鼠中磷脂的变化。这些家族性阿尔茨海默病（FAD）模型老鼠展示了淀粉样蛋白前体蛋白中的3个突变型（瑞典型、佛罗里达型和伦敦型）和Presenilin1的两个突变（M146L和L286V）型。这些小鼠在2个月后反映出快速发展的Aβ1?42的大量沉积、p25和神经元的过度表达[52]。在3只3个月和9个月老鼠的新鲜冷冻脑组织切片上进行MALDI MSI，并与年龄匹配的对照样进行比较，使用CHCA?DHB（1∶1，V/V）混合液作为基质，在阳离子和阴离子模式下，横向分辨率为150 μm时，发现脑组织区域首先积累淀粉样斑块，并且额叶皮质中磷脂32∶0 PC和下托管中32∶0 PC、34∶1 SM和34∶1 PC的丰度明显降低，而16∶0 LPC在9个月的5XFAD小鼠额皮质和下丘脑组织中均增加[18]。但是，共定位染色没有显示淀粉样斑块的这些特征。

    Zhang等[53]研究发现，利用MALDI MSI对鼠脑组织中的神经节苷脂进行原位成像质谱分析时，在负离子模式下，3?氨基喹啉是最适合对神经节苷脂检测的基质，并且应用70%乙醇和95%乙醇对鼠脑组织切片进行预处理，可使成像信号增强。最后，在最适宜的条件下，对AD模型鼠脑组织中的神经节苷脂进行了成像。与正常鼠脑组织相比，AD模型鼠脑组织右脑组织中神经节苷脂大量减少，小脑组织中神经节苷脂几乎消失，免疫染色结果发现，这两个部位出现Aβ沉积，推测这可能是由于Aβ沉积与不饱和的神经节苷脂反应造成的（图3）。该实验结果为研究老年痴呆症的发病机理研究提供了新的视角。

    3.3?人类AD患者脑组织中Aβ和脂质的分布

    Rohner等[54]对AD患者的脑组织进行质谱成像分析，从质谱图中挑选出2个高表达的信号峰，其中m/z 4330.9的多肽集中分布于颅顶骨、枕骨的皮质突出部;m/z 4515.1的多肽集中分布于海马区域。与正常组织成像相比，具有明显的空间特异性分布。进一步鉴定这两种蛋白，发现它们都为Aβ淀粉样多肽，其中m/z 4330.9为Aβ1?40多肽，m/z 4515.1为Aβ1?42多肽。而AD的病理特征之一是在老年斑和血管壁上出现这些β淀粉样多肽的沉积物，因此研究者推测这些多肽在脑组织组织中的出现可能与阿尔茨海默病的发病机制有关。

    Kakuda等[55]采用MALDI MSI检测一系列Aβ肽类在尸检人脑组织中的空间分布。通过一些技术上的改进（如对冰冻脑组织标本进行甲酸预处理），获得如下结果： （1） Aβ1?42和Aβ1?43选择性沉积于老年斑SP中，全长的Aβ肽（如Aβ1?36、1?37、1?38、1?39、1?40和Aβ1?41）则沉积于软腦组织膜血管中; （2）采用MALDI MSI观察到N末端截短的Aβ1?40和Aβ1?42（包括第3位谷氨酸被焦谷氨酸修饰）的差异性沉积; （3） Aβ1?42和Aβ1?41之间仅C末端单一氨基酸的改变即可导致它们分布方式的巨大差异，这或许是由于Aβ1?40、Aβ1?41和Aβ1?42之间在体外自聚集能力的差异。使用新研制的Aβ1?41抗体的免疫组织化学进一步验证这些结果， 采用MALDI MSI观察到，Aβ肽类截短或修饰的C末端和N末端片段在AD患者脑组织中的差异性分布呈现时空特异性。特别是，MALDI MSI和IHC均检测到Aβ1?41，表明仅改变Aβ的C末端一个氨基酸，即可导致显著的分布变化

    虽然MALDI MSI常用于蛋白质和肽分析，但也可检测脂质分布的变化。Yuki等[56]研究了死后人脑组织中的鞘脂硫酸盐的羟基化和非羟基化的物种的分布。有研究表明，硫苷脂（鞘脂的主要成分）的减少是潜在的早期AD病理特征，可能是在疾病中发现的皮质去鞘脂和少突胶质细胞变性的一种潜在的分子机制[57]。与健康控制组大脑组织相比，在白色到灰质的边界，AD大脑组织羟基化与非羟基化的鞘脂硫酸盐物种比率不同[56]。虽然结果需要进一步完善和确定， 但以上这些结果表明，通过羟基化生成鞘脂硫酸盐的机制是AD中鞘脂硫酸盐异常的基础。

    随后，Yuki等[58]对含有磷脂酰胆碱的二十二碳六烯酸的种类（DHA?PC）在AD患者脑组织中和正常对照组的分布进行了比较（空间分辨率： 50 μm）。 受AD影响的大脑组织颞叶、顶叶和额叶部位的灰质中16∶0/22∶6 DHA?PC和18∶0/22∶6 DHA?PC的相对强度较低，而16∶0/16∶0 DHA?PC的相对强度没有改变（图4）。此外，还确定了18∶0/22∶6 DHA?PC的减少与AD疾病持续时间及早期的死亡年龄相关[59]， 推测是由于DHA?PC的裂解产物可作为抗凋亡因子。 因此，AD患者脑组织中DHA?PC强度较低会影响神经细胞死亡[60]。

    4?總结与展望

    结合临床、遗传和病理学观察，MALDI MSI检测到淀粉样蛋白Aβ及部分脂质在小鼠AD模型和人类AD患者脑组织中的分布，但由于其它含量丰富的物质的干扰及其自身复杂的结构，使得AD中Aβ蛋白和脂质的研究仍充满挑战。未来，随着新型基质的不断开发、新的样品制备方法的涌现、仪器性能的不断改进和提高， MALDI MSI技术可作为深入了解AD病理机制的有效方法，为Aβ和脂质在AD脑组织中的精确分布及两者之间相互作用对AD发生和发展的影响的研究提供支持。

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    Research Progress of Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

    Mass Spectrometry Imaging of Alzheimer's Disease Brain

    ZHANG Yang?Yang*1， HAN Chao1，2， ZHAO Zhen?Wen*1，2

    1（Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

    2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

    Abstract?Alzheimer's disease （AD） is an age?related neurological disorder， affecting millions of people around the world， but the exact cause of the disease remains unclear. Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging （MALDI MSI） analysis technology not only enables material identification， but also spatially images the analytes. In recent years， MALDI MSI technique has been widely applied to the study of the distribution of β?amyloid （Aβ） and lipid in AD brain tissue. The principle， methodology of MALDI MSI and related research progress of the mechanism of AD treatment were reviewed in this paper， and the prospects for its development were also anticipated.

    Keywords?Alzheimer's disease; Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging; Review