神经环路示踪工具病毒的研究进展

    韩增鹏　施祥玮　应敏　郑宁　李梅　张志建　 吴阳　王华东　王杰　胡亮　贾凡　徐富强

    

    

    

    摘?要?脑是机体最为复杂的系统，决定着情感、记忆、学习等生理活动。神经环路是脑行使功能的基础，明确神经环路的构成和工作原理，对于认识脑、利用脑和保护脑具有十分重要的意义。神经环路结构和功能解析涉及环路标记、成像和数据分析等。本文以环路标记为出发点，重点介绍了以嗜神经病毒为基础的神经环路示踪工具体系及其应用技术，阐述了常用的嗜神经工具病毒类别及其特性、遗传改造、选用原则及应用限制等问题，并对不跨突触示踪工具系统、跨单级突触示踪工具系统和跨多级突触示踪工具系统进行介绍，以期帮助读者了解当前脑科学研究中不可替代的环路标记新方法及其研究新进展。

    关键词?神经环路; 示踪工具病毒; 逆向跨突触; 顺向跨突触; 辅助工具病毒; 评述

    1?引 言

    数目庞大、形态各异的神经元经突触连接构成的神经网络是大脑行使感覺、运动、情感、认知等复杂活动的结构基础，认识神经系统中神经元之间的连接方式是当前神经科学研究的挑战之一。经典的示踪剂被广泛用于确定实验动物不同脑区之间神经元的连接： 如可被轴突末端吸收并沿轴突逆行示踪的霍乱毒素b亚基（CTb）、辣根过氧化物酶（HRP）等[1，2];可被神经元胞体和和树突吸收并沿轴突顺行示踪的植物血凝集素（PHA?L）、葡聚糖胺（BDAs）等[3，4]。这些示踪剂有如下缺点： （1）无法实现细胞类型特异性标记; （2）跨突触效率不稳定; （3）无法实现多级神经网络的标记，信号衰减严重。嗜神经病毒示踪技术为这些问题的解决提供了新方案，并使遗传改造后的病毒成为追踪神经突触连接的有效工具[5]。

    重组病毒载体作为示踪工具，因其载体本身具有不同的特性而适用于不同的标记策略（如是否跨突触、沿神经环路顺向或逆向运输等）; 每种载体又可通过携带不同报告基因或特定功能元件，实现神经元精细形态标记、神经网络的结构可视化或特定功能的标记，结合重组酶（如Cre或Flp）或特异性启动子，可实现细胞类型特异标记。

    2?神经环路研究中常用的病毒载体和可携载的功能元件

    2.1?神经环路研究中常用的病毒载体

    目前，应用于神经环路标记的病毒工具多由嗜神经病毒改造而来，嗜神经病毒是一类能感染神经细胞，且能够跨突触沿神经环路传播的病毒，如伪狂犬病毒（Pseudorabies virus， PRV）[6]、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 1， HSV）[7]、狂犬病毒（Rabies virus， RV）[8]、水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus， VSV）[9]等。此外，一些不跨突触的病毒载体可高效原位标记神经元精细形态，如塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus， SFV）[10]; 或作为辅助病毒表达外源基因，如腺相关病毒（Adeno?associated virus， AAV）[11]; 也可用于展示局部脑区的上游投射，如2型犬腺病毒（Canine Adenovirus 2， CAV2）[12，13]。神经环路示踪常用的重组病毒载体见表1。

    因病毒载体对动物种属或组织细胞类型的感染嗜性存在差异，不同的病毒载体适用于不同的研究对象，而且每种病毒工具又可通过携载各种元件满足不同的研究需求。

    2.2?常用工具病毒可携载的功能元件

    重组病毒作为一种新兴的神经示踪工具，在解析神经环路的研究中具有诸多优势，包括： （1）具有灵活的遗传可操作性; （2）可携带不同的标示物及功能探针等， 可实现对特定类型神经元及环路的结构和功能的研究。

    可视化标记是神经元及环路结构研究的基础。重组工具病毒可携带多种报告基因（如： 可通过免疫荧光显色的蛋白标签、可与底物反应显色的半乳糖苷酶、可直接显示颜色的GFP、RFP、YFP等荧光蛋白）， 实现对神经元形态或神经环路结构的可视化标记。在此基础上，携载脑虹元件，工具病毒可用于抽提更复杂的神经网络信息; 携载胞核、胞体、树突以及轴突定位元件，可实现对不同亚细胞结构的选择性或富集标记; 通过将荧光蛋白拆分之后分别表达于突触前和突触后，可实现对突触结构的精细标记[14]。近年来，通过病毒载体携载磁共振成像报告蛋白（如铁蛋白），使得基于磁共振成像的更精细的神经环路的活体解析成为可能[15，16]。通过与嗜神经病毒载体的结合，磁共振成像报告基因已被用于细胞迁移、基因治疗、神经可塑性及胚胎发育等过程的活体示踪与监测。

    神经环路功能的研究手段可分为神经活动的监测和操控两方面。基于Ca2+浓度变化的荧光成像技术已被广泛用于神经活动的实时监测。由钙调蛋白CaM、环状序列改变的增强型绿色荧光蛋白cpEGFP和M13多肽序列融合而成的GCaMP是目前最常用的钙离子浓度探针[17～20]。但以往的GCaMP探针在长时程、高表达的情况下容易在细胞核中积累，导致细胞毒性和反应变慢等副作用，近期，Yang等[21]在此基础上引入可特异结合apoCaM的保护元件构建的GCaMP?X，成功克服了这些缺陷，优化了钙离子探针的性能。上述钙离子探针可监测神经环路的瞬时活动状况，但无法永久标记特定时刻被激活的神经元，因而无法对其形态结构、细胞类型等进行后续研究。通过将GCaMP中的cpEGFP替换为光转换荧光蛋白mEos2，获得的CaMPARI可实现对瞬时活动的神经元的永久标记[22～24]： 在正常状态，在高浓度Ca2+存在的情况下，表现为GFP绿色荧光蛋白构象的CaMPARI给予紫外光照射处理，就会不可逆、永久地转变成红色荧光（Red）的构象。除了依赖Ca2+浓度变化之外，近年来，研究者也开发了多种基因编码的神经递质探针，如检测多巴胺的dLight1[25]、GRABDA（DA1m、DA1h）[26]，以及检测乙酰胆碱的GACh2.0[27]等。这些神经递质探针都是基于相似的原理，即利用天然的神经递质的G蛋白偶联受体（GPCR），用对结构变化敏感的荧光蛋白cpGFP/cpEGFP代替相应的人源神经递质受体C端的ICL3。当神经递质与经过改造的受体结合时，受体构象变化，引起cpGFP/cpEGFP构象改变，使绿色荧光信号增加，当神经递质浓度降低时，此过程逆向进行，荧光迅速减弱[25～27]。通过记录绿色荧光信号强度变化，可实时检测神经递质的浓度水平。此外，还有其它神经活动监测的探针，如细胞膜电位变化敏感的探针、pH值变化敏感的探针等。

    目前，工具病毒可携载的神经功能操控元件主要包括光遗传和化学遗传等元件。光遗传学允许利用不同波长的光激活或抑制神经元，Channelrhodopsin?2（ChR2）[28]是最早在神经元中实现高效光遗传学操控研究的光敏感离子通道蛋白，在470 nm左右蓝光作用下，ChR2可开放细胞膜上的非选择性阳离子通道，激活神经元。目前已开发出了多种具有不同特性的可用于激活神经元的光敏感离子通道蛋白突变体，如ChR2（H134R）通过将第134位氨基酸由组胺酸突变为精胺酸，可产生2倍于野生型ChR2的光电流; ChETA在高频率激光刺激下可使神经元产生200 Hz的动作电位发放; C1V1和ReachR可被“红移”激光激活等。基于氯离子通道以及氢离子泵，构建了多种可抑制神经元活动的光遗传元件，其中Halorhodopsin（NpHR）[29]是第一個可有效抑制神经元的光敏感离子通道蛋白，改良的eNpHR3.0可在细胞膜上高度富集，降低了光功率需求同时也增强了抑制效率，其在593 nm左右黄绿激光照射下可将Cl转入细胞内，使细胞发生超极化，可抑制神经元; Archaerhodopsin（Arch）[30]在黄光作用下可将H+泵出细胞，沉默神经元; Leptosphaeria maculans fungal opsins（Mac）可通过蓝光刺激抑制神经元[31]; 而Anion channelrhodopsins （ACR）[32]在蓝光作用下每分钟可转导104～105个Cl，效率比传统的NpHR和Arch高102～104倍。这些具有不同特性的光遗传功能蛋白的开发极大地丰富了光遗传学的研究手段。化学遗传学通过设计特定惰性小分子激活的受体（Designer receptors exclusively activated by designer drugs， DREADDs）蛋白[33，34]，并使其分别偶联Gq、Gi、Gs、Golf和β?arrestin等介导细胞内不同信号转导通路的G蛋白偶联受体，利用该惰性药物激活相应的GPCR信号通路，进而影响细胞生理活动。现有的DREADDs系统多采用N?氧化氯氮平（Clozapine?N?oxide，CNO）作为激活配体，并且已开发出多种DREADDs系统，包括神经科学研究中应用最广泛的可兴奋神经元的Gq?DREADD（hM3Dq[35]）和可抑制神经元的Gi?DREADD（hM4Di[36]等），此外，Vardy等[37]基于k?阿片受体开发的KORD化学遗传蛋白可与SALB（Salvinorin B）特异性结合，激活Gq通路、抑制神经活动，丰富了化学遗传元件的多样性，并且允许利用不同的小分子配体同时激活和抑制不同神经元。

    3?适用于不同研究需求的标记系统

    目前，适于不同研究需求的神经环路标记系统主要分为不跨突触的标记系统、跨多级突触的标记系统和跨单级突触的标记系统（图1）。

    3.1?不跨突触的标记系统

    3.1.1?高效原位转导的标记系统?重组腺相关病毒载体（rAAV）是一种在非致病的野生型AAV基础上改造成的新型基因载体。因受到AAV自身基因包装容量的限制，rAAV携带的外源基因片段长度一般不超过5 kb[38]。rAAV具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、病毒血清型种类多、可感染分裂和非分裂细胞、能介导基因在动物体内长期稳定表达等特点，被广泛用于外源基因在特定类型神经细胞中的表达，以及通过使用不同类型神经细胞的特异启动子控制外源基因的表达; 另外，rAAV也被广泛用于携载各种分子遗传元件实现神经环路的范围、连接方向、神经元类型等的可控性标记及神经环路的监控和操纵[11]。Wu等[39]优化了基于杆状病毒系统大规模生产rAAV的方法，大大提高了rAAV载体制备方法的通用性和灵活性。

    VSV病毒载体： VSV囊膜糖蛋白G为其跨突触必需蛋白。G蛋白敲除的VSV病毒不能跨突触传播，但仍具有可在感染后短时间内高丰度地表达外源蛋白、宿主范围广等优势，因此具有对不同物种神经元实现快速、高亮标记的潜在应用价值，进一步借助EnvA/TVA系统可控制所标记的神经元的特异性[9]。但由于VSV对标记的神经元细胞有相对较大的细胞毒性，需对其进行进一步减毒改造。

    SFV病毒载体： SFV也可在感染后短时间内高丰度地表达外源蛋白，使用VSV?G或RVG包装的假型SFV可将EGFP递送到神经元中，实现局部神经元的非特异性快速标记[10]。

    3.1.2?经轴突末端感染逆行标记的载体系统

    狂犬病毒载体： RV的囊膜糖蛋白受体大量分布在神经元轴突末端，因此RV病毒可沿轴突逆行感染进入神经元并开启病毒复制。Wickersham 等[40]利用反向遗传学手段对狂犬病毒疫苗株SAD?B19进行改造，将RV基因组中病毒跨膜必须的G蛋白基因敲除换成荧光蛋白基因（如mcherry或eGFP），并用细胞系补偿表达病毒包装所需的G蛋白，最后获得可感染神经细胞的缺陷型重组RV。RV?ΔG?eGFP病毒只能进行单次感染，能够标记感染的单个神经元的形态和亚细胞结构[40]。RV?ΔG是“逆行示踪剂”，可在体内用于直接鉴定投射型神经元。这种逆行标记示踪病毒与经典的非病毒性逆行示踪剂（如霍乱毒素亚单位（CTb）等）的作用相似，然而有其独特的优点，RV?ΔG病毒载体复制转录不受影响，仍可高丰度持续表达外源基因，高亮标记所感染的神经元[40，41]。

    犬腺病毒载体： CAV?2可高效感染神经元轴突末梢，逆行标记神经元[12，13]，然而CAV?2仅允许中等强度的转基因表达，并且显示出一定的毒性[42]，病毒生产系统的稳定性、通用性也有待提高[43]。

    Retro?AAV载体： Tervo等运用定向进化策略，通过建立AAV衣壳突变体文库，筛选到一种新的AAV突变体（rAAV2?retro）， 可通过轴突末端感染有效地对投射类神经元逆行标记[44]。

    HSV?1扩增子载体： Amplicon是基于HSV制备的一种假型病毒载体，扩增子质粒由细菌复制起始的细菌质粒骨架载体、HSV?1 的顺式作用元件复制起始点ori、切割包装信号pac和外源基因表达盒构成。该载体不表达HSV的结构基因，为完全的复制缺陷性载体，可用于神经元轴突末端起始逆行标记[45～47]。

    3.1.3?稀疏高亮标记系统?绘制不同脑区之间神经元连接图谱是神经科学研究的基础工作之一。鉴于特定脑区中神经元往往呈现功能和形态的特异性，许多研究致力于精细标记特定区域特定神经元的完整形态[48]。由于不同神经元的轴突和树突紧密地缠绕而难以区分，因此“稀疏”且“高亮”地描绘单个神经元完整的形态成为实现单细胞标记的两大挑战[49，50]。

    利用病毒工具标记局部神经元的单细胞完整形态主要可借助以下3种途径实现： （1）依赖高效转导的标记系统，因载体病毒（VSV、SFV等）少量初始感染即可高丰度表达荧光蛋白，通过降低病毒滴度控制稀疏度， 即可实现对局部神经元完整形态的快速、稀疏、高亮标记[51]; （2）混合表达某种“触发因子”（如Cre重组酶）和依赖此“触发因子”表达荧光蛋白（如Cre依赖的DIO元件）的两种病毒，通过稀释前者的滴度控制被标记神经元的稀疏程度，利用后者特异性高亮标记神经元的精细形态。Economon等[52]将低滴度的表达Cre重组酶与高滴度的携带DIO元件的两种AAV病毒混合，实现局部神经元的稀疏高亮标记，在小鼠大脑运动皮层中稳定、高亮度地标记了10～50个神经元，并描绘了其全脑范围精细的轴突投射情况; （3）借助TRE启动子的泄漏表达实现“稀疏”标记、同时借助tTA/TRE的正反馈机制实现荧光蛋白“高亮”表达的“Supernova”系统[53，54]。Zhou等[55]通过在原始“Supernova”系统中引入一对新的正交重组酶组合，修改稀疏标记系统为由两种rAAV组成，实现了细胞数目可控的、特定细胞类型神经元的稀疏高亮标记; 并借助DreO和vCre位点特异性重组酶，实现多色标记，同时扩展了标记系统的通用性。

    大规模神经网络的协同作用依赖于长程投射神经元将局部环路模块连接在一起[56]，因此，选择靶向标记具有特定投射特征的神经元有助于理解神经元的功能实现方式[44]。为了对有特定投射的神经元进行单细胞形态标记，需要轴突末端感染进入并沿轴突逆行标记神经元的示踪工具病毒。实现这一标记目标的方法有两种： （1）使用RV等可由轴突末端吸收并可凭借自身基因组复制转录，高丰度表达目的基因的病毒。Wickersham等[8]基于RV疫苗株SAD B?19进行遗传改造，将荧光蛋白基因置于RV基因组靠近起始端，提高了外源基因表达水平，实現了单细胞逆向清晰标记或多色标记。受限于RV病毒复制及表达特性，目前尚无法实现神经元特异性标记; （2）使用rAAV2?retro、CAV?2等载体，这些病毒载体自身基因组虽无法复制，但可沿轴突逆行运输并表达一定量的Cre重组酶，启动上游携带DIO元件的标记病毒的荧光蛋白高亮表达，实现对具有特定投射类型的神经元逆向清晰标记。Zhou等[55]基于“Supernova”系统，结合rAAV2?retro携带Cre重组酶逆向标记策略，实现特定类型、投射特异性神经元的稀疏高亮标记。

    哺乳动物的单个神经元接受多达数千个突触输入，为了实现特定类型神经元起始的单细胞跨突触逆行环路示踪，Wickersham[57]及Marshel [58]等基于双光子引导的单细胞电穿孔技术，利用RV?EnvA系统，实现了由单个神经元起始，跨突触追踪投射到该神经元的上游神经网络。Wertz等[59]结合钙成像技术，将这一标记系统由单纯的结构标记扩展到功能性网络分析。用于稀疏高亮标记的不同种类病毒的特点见表2。

    3.2?跨多级突触的标记系统

    嗜神经病毒本身的感染嗜性决定其可沿神经环路跨突触传播。HSV1 H129株和VSV具有顺向跨突触传播的能力，而RV和PRV?Bartha具有逆向跨突触传播的能力。这些病毒可用于研究大脑特定区域的全脑范围多级输入和输出网络结构，认识神经发育过程中的神经网络变化，以及追踪外周器官与中枢神经系统间的联系通路等。

    3.2.1?顺行跨多级标记?特异性顺行跨突触应用最多的病毒是单纯疱疹病毒1型 H129株[60，61]。在神经环路示踪研究中发现， H129具有顺向跨突触传播特性，和神经冲动传递的方向一致，适合于神经输出环路的示踪研究[62，63]。HSV病毒载体还具有以下优点： （1）基因组序列结构、遗传背景清楚，便于分子遗传改造; （2）近一半基因为非必需基因，外源基因容载量高达40 kb，可携带复杂调控元件和多样外源基因; （3）宿主范围广，能有效感染斑马鱼、啮齿类和非人灵长类等多种生物，普适性好[64～66]。HSV?H129株作为神经示踪工具已近三十年，在啮齿类动物、非人灵长类动物神经示踪中证实了H129的顺行跨突触标记特性[60，67，68]。 如Dum等[69]利用不表达荧光的野生型H129，用抗HSV的多克隆抗体做免疫组化显色成像，在卷尾猴模型示踪脊髓?丘脑系统（参与疼痛和热感信息传递）靶向投射到大脑皮层的特异运动和感觉区，这些靶标脑区和人类受到疼痛刺激时大脑皮层被激活的脑区具有很好的一致性。 也有研究采用携带荧光蛋白基因的重组H129实现神经环路示踪[70]，如McGovern[71，72]和Vaughan [73]等构建了表达EGFP的重组病毒H129?EGFP，通过感染动物上呼吸道示踪上行感觉神经通路。为实现细胞类型特异性标记，Lo等[7]利用同源重组的方法敲除HSV复制必需基因（TK），构建了Cre重组酶控制荧光蛋白表达及HSV跨突触的重组病毒H129ΔTK?TT，在Cre转基因小鼠中实现细胞类型特异性的顺行跨多突触全脑追踪。该重组病毒在Cre小鼠的小脑浦肯野细胞、视觉等神经环路进行了示踪研究。McGovern等[74]开发并验证了一种基于H129株的新型条件性表达的神经网络顺向病毒示踪系统，利用其对呼吸道传入神经通路的中央投射进行了示踪研究。Wojaczynski等[63]构建了3种表达不同荧光的重组H129病毒，通过对基底神经环路和视觉神经系统的示踪标记，进一步证实了H129及其重组株具有较好的顺行跨突触传播特性，但同时存在延迟的逆向跨突触传播。Su等[75]发现H129工具病毒存在一定的注射部位轴突末梢感染导致的非特异逆标，所以利用H129在长感染时间（>3天）的输出环路追踪时对结果需谨慎翻译。除了HSV，Beier等[76]测试了VSV在啮齿类动物大脑中的顺行跨突触能力和神经元感染的特异性，之后又进行了一系列设计和改造工作，实现了VSV对特定神经网络跨多级的顺向标记示踪。

    3.2.2?逆行跨多级标记?PRV Bartha株能严格逆行跨突触在神经元之间传播[6]。PRV Bartha最初被用于通过注射外周组织研究传出神经通路，以及通过抗体免疫组化研究外周神经通路。在PRV Bartha株的基础上，通过加入β?半乳糖苷酶、荧光蛋白基因等元件，构建重组病毒，使被病毒感染的细胞可视化，实现对神经环路的可视化研究[77～80]。在仓鼠玻璃体腔注射可表达绿色荧光蛋白的PRV Bartha衍生物PRV?152后，病毒仅通过自主神经回路逆向跨突触传播，感染视交叉上核[81]。肾功能的神经控制由中枢神经系统通过肾的交感神经支配实现。Cano等[82]为了确定大脑控制两个肾脏的共有神经支配模式，使用双标记系统追踪了在个体大鼠中同时参与两个肾脏神经支配的神经元。Banfield等[78]构建表达红色荧光蛋白的PRV Bartha重组病毒PRV?614，建立双病毒跨神经元标记技术，研究单个神经元与大脑中的多个神经回路之间的连接，尽管如此，PRV?152和PRV?614存在表达效率低的问题，需要通过免疫组化放大信号才能获得完整的标记结果，因此给研究带来了不便。基于该问题，Jia等[83]优化了报告基因的表达水平，构建了两个新的逆行跨多突触示踪病毒PRV531和PRV724。PRV条件性表达神经网络逆向病毒示踪系统是基于Cre?LoxP系统。在特异性表达Cre重组酶的细胞中感染PRV?Bartha 衍生物Ba2001，在Cre存在的条件下，该病毒衍生物才允许表达GFP及胸苷激酶， 逆向跨突触传播。DeFalco等[84]使用Ba2001和在神经肽Y或瘦素（ObRb）启动子下表达Cre的小鼠，研究进食行为下的神经网络。PRV示踪还可用于量化神经元连接的动态，观察发育过程中大脑突触的形成，评估发育、 神经变性和修复中的突触可塑性[85，86]。野生型RV病毒也具有逆行跨多级的特性，囊膜糖蛋白G为跨突触必须蛋白，受体大量分布在轴突末端。基于野生型RV构建的标记工具可用于外周神经网络向中枢神经系统的输入网络示踪。利用RV衍生物RV?b2c?egfp （EGFP插入在RV?b2c品系的G和L序列之间）注射在小鼠腘窝淋巴结，逆向追踪在中枢神经系统的上游多突触回路[87]。

    3.3?跨单级突触的标记系统

    跨多级突触的标记方式难以区分轴突连接层次的上下游关系，因此在神经环路标记中需要开发跨单级突触的标记系统。跨单级突触标记系统的标记工具构建原理一般是将病毒跨突触所必须的蛋白缺失，在感染细胞后，通過辅助病毒（如rAAV等）反式补偿该蛋白，使感染的病毒粒子完成跨突触事件，病毒进入二级神经元后，由于缺少跨突触必须的蛋白，因此不能继续沿突触向下一级传播。

    3.3.1?顺行跨单级标记?Zeng等[88]基于HSV1 H129细菌人工染色体，通过删除HSV复制必需基因TK并引入tdTomato荧光基因表达框构建， 获得H129ΔTK?tdT，该病毒感染神经细胞不能复制跨突触，当用AAV辅助病毒补偿表达TK蛋白可实现HSV顺行跨单级突触示踪标记。rAAV是一种复制缺陷型的假病毒载体。Castle等[89，90]的研究表明，AAV1可沿着轴突顺行运输，然而其潜在的跨突触传播机制仍不清楚，且存在争议[91～94]。近来，Zingg等[95]为1型和9型AAV表现出的顺行跨单级突触传播提供了证据，实现了突触前神经元感染高滴度的AAV1?Cre能有效跨一次突触且特异性地驱动Cre依赖的外源基因在突触后神经元中表达， 实现AAV1型顺行跨单级突触传播和标记神经元的功能操控。AAV1病毒颗粒顺行跨单级突触的机制目前并不清楚，而且存在AAV1感染所需滴度高、跨突触效率低，只能携载Cre重组酶再诱导突触后神经元基因表达等限制因素。

    3.3.2?逆行跨单级标记?G蛋白缺失的RV感染神经元后不能复制子代病毒传播到起始细胞之外，除非在起始细胞内通过辅助病毒反式补偿足够的RV G蛋白，以便病毒完成包装后跨突触到突触前神经元。这可通过不同方式实现，例如利用辅助病毒或转基因动物在特定细胞中表达相应的组分，结合EnvA/TVA系统可实现细胞特异性起始感染（图2）[96]。Reardon等[97]

    构建了缺失G蛋白的RV的CVS?N2C株，CVS?N2C毒株比SAD?B19株系的逆行跨突触传播效率更高。

    缺失G蛋白的RV的细胞毒性并未完全消除，Ciabatti等[98]利用基因工程手段，将一段烟草蚀刻病毒蛋白酶体靶向结构域的切割序列PEST和N蛋白连接， 能将RV病毒在感染的神经元中持续表达2周后被蛋白酶体清除掉，大大降低对细胞的毒性[98]。与HSV顺行跨单突触原理类似，疱疹病毒科病毒PRV也可通过删除复制必需基因TK，并引入荧光基因表达框，构建可逆行跨单级的病毒载体。

    3.4?基于腔室系统的定向神经网络用于病毒体外评估与机制研究

    三腔系统或微流体芯片通过在培养基底上设立隔断的细胞小室，操控神经轴突定向生长，并实现其与胞体的隔离，进而模拟离体神经网络，用于病毒感染和传播特性的快速评估与机制研究。该方法允许病毒特异感染极化的胞体或轴突末端，同时满足对感染过程实时监测的需求。

    研究者探讨了RV在末梢生长锥的内化进入及在轴突中双向运输的机制，并评估了药物如干扰素和土根碱对其逆向运输的影响[99～102]; 从离体神经元水平再现了疱疹病毒如HSV和PRV的潜伏感染，并以此讨论潜伏与重激活可能存在的机理[103～110]; 通过病毒颗粒与蛋白的荧光可视化，研究了AAV轴突转运的相关机制[89]。另一方面，借助腔室实现与非神经细胞的共培养，可用于病毒传播的机制研究，由此论证了gD、gB与Us9蛋白在PRV和HSV正向传播中的关键作用[111，112]。此外，近年兴起的类器官技术，帮助研究者在体外水平成功模拟肝炎病毒HBV的临床感染特性[113]。在未来，以微流体及三维组织培养相结合的方案，有望实现更接近活体水平的、投射模式可控的神经网络，加速工具病毒的研究进展。

    4?展 望

    現有的跨突触示踪工具病毒可用于包括果蝇[114]、线虫[115]、斑马鱼[116]、大小鼠[117，118]、树鼩[119]、非人灵长类动物[120～122]等在内的模式动物。不同嗜神经病毒的天然感染宿主范围有所不同，RV、HSV、VSV感染宿主范围广，能应用于果蝇、斑马鱼、大小鼠、非人灵长类猴等动物的神经环路示踪[69，114]。PRV可应用于除非人灵长类动物之外的其它动物神经环路示踪[6，123]。除跨突触示踪工具病毒外，环路研究常用的辅助病毒（如rAAV等）能感染从果蝇、斑马鱼到啮齿类、非人灵长类动物等的大多数模式动物，已有很广泛的应用[124，125]。

    尽管如此，现有的工具系统仍然存在一些限制或问题： （1）针对不同模式动物的示踪工具尚不健全，缺乏高效的灵长类神经环路示踪工具; （2）现有的工具存在毒性，限制了其应用范围，如长时程的功能环路的解析; （3）病毒表达外源蛋白效率较低，给实验过程带来不便; （4）工具病毒制备工艺也亟待升级，以便高效率地生产高质量的病毒载体等。

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    Tools for Neural Circuit Tracing Based on Neurotropic Viruses

    HAN Zeng?Peng1，2， SHI Xiang?Wei1，2， YING Min1，2， ZHENG Ning1，2， LI Mei1，

    ZHANG Zhi?Jian1， WU Yang1， WANG Hua?Dong1，2， WANG Jie1，2， HU Liang1， JIA Fan1，2， XU Fu?Qiang1，2

    1（Brain Research Center， Wuhan Institute of Physics and Mathematics，

    Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China）

    2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

    Abstract?The brain is probably the most complex system. Neurocircuits， formed by various types of neurons through synaptic connections， are the basis of brain functions， from the basic homeostasis， senses and perception， for learning， memory， decision?making， and consciousness. Therefore， it is of great significance to understand the component and working principle of neurocircuits， so as to recognize， utilize and protect the brain. Techniques for exploring the structure and function of neurocircuits include circuit?tracing， manipulating， imaging and data?analyzing. In this paper， we focus on the neurocircuit tracers based on neurotropic viruses and its application technology. The categories and characteristics， genetic modification， selection principles and application limitations of commonly used neurotropic viral tools will be discussed. The non?transsynaptic tracer system， the trans?monosynaptic tracer system and the trans?multisynaptic tracer system are also introduced to help readers understand the commonly used circuit tracing methods and research progress.

    Keywords?Neural circuit; ?Tools based on neurotropic virus; ?Retrograde; ?Anterograde; ?Helper virus; Review