超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱法测定血液中11种喹诺酮类药物残留
王春 袁文峰 顾传坤 王长海 马强
摘 要 建立了检测血液中11种喹诺酮类药物残留的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱方法。以正己醇、四氢呋喃和水形成的超分子溶剂为萃取溶剂，对血液样品中的喹诺酮类药物进行分散液液微萃取。采用单因素试验和正交试验考察了超分子溶剂组成、用量和涡旋时间等参数对萃取效率的影响。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）色谱柱分离，以乙腈-0.15%（V/V）甲酸为流动相梯度洗脱，在电喷雾正离子模式下，利用多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式进行定性定量分析。结果表明，11种喹诺酮类药物在各自线性范围内线性关系良好（R>0.998）， 检出限为0.1～0.8 μg/L， 定量限为0.4～2.0 μg/L。在高中低3个加标水平下，11种喹诺酮类药物的回收率为70.8%～115.2%， 相对标准偏差为3.0%～11.5%（n=6）。
关键词 超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱;超分子溶剂;分散液液微萃取;喹诺酮类药物
1 引 言
喹诺酮类药物是一类具有抗菌作用的人工合成药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、毒副作用小、价格低廉等特点，被广泛用于治疗各种感染性疾病。然而，该类药物容易导致耐药菌株的产生，且具有潜在的致癌性和遗传毒性，可能对人体健康造成潜在风险[1， 2]。在畜牧和养殖领域，由于不合理用药、不遵守休药期等原因，導致药物可能会超标残留于生物体内。为确保动物源性食品质量安全，开发喹诺酮类药物残留的检测方法至关重要。目前，《中华人民共和国药典》（2015年版）中针对喹诺酮类药物的检测方法主要为分光光度法和高效液相色谱法[3]，文献报道的方法包括高效液相色谱-串联质谱法[4～6]、毛细管电泳法[7，8]、酶联免疫法[9，10]和胶体金法[11]等。其中，分光光度法、酶联免疫法和胶体金法操作简单，但选择性较差，灵敏度较低;毛细管电泳法快速高效，但分离重现性较差。高效液相色谱-串联质谱法兼具灵敏度高、特异性好等优势，是目前喹诺酮类药物残留检测的常用方法。
三重四极杆/复合线性离子阱质谱是一种混合型串联质谱仪，其设计是将传统三重四极杆质谱仪的最后一个四极杆改为线性离子阱，并可完成快速自由切换，即最后一个四极杆同时具备传统四极杆和线性离子阱的功能，既保留了串联四极杆的选择性和灵敏度优势，也可实现线性离子阱增强二级碎片离子定性功能[12，13]，有利于提高复杂样品基质中痕量目标化合物的准确定性能力。三重四极杆/复合线性离子阱质谱已被广泛应用于生物样品的分析检测[14，15]。
样品前处理方法很大程度上决定了分析方法的灵敏度和准确性。由于血液样品中含有大量的蛋白质、磷脂和内源性代谢物，因此有必要开发合适的样品前处理方法，以消除样品基质干扰，提高检测结果的准确性。超分子溶剂是指由两亲性化合物通过两相或分子间有序自组装过程形成的一种具有纳米结构的胶束聚集体[16]。超分子溶剂萃取是一种新型绿色萃取方法，成本低廉，操作简便，可替代常规液液萃取中使用的有机溶剂 [17]，通常情况下多使用长链烷基醇或烷基酸与四氢呋喃和水混合，形成不溶于水的反向胶束。由于其出色的萃取性能，超分子溶剂也被广泛应用于样品前处理过程[18]。
目前，将超分子溶剂萃取和三重四极杆/复合线性离子阱质谱联用用于喹诺酮类药物检测的方法鲜有文献报道。本研究采用超分子溶剂分散液液微萃取方法对血液中的喹诺酮类药物进行萃取，将萃取与净化同步完成，对影响萃取效果的烷基醇种类与用量、四氢呋喃用量和涡旋时间等主要条件进行了单因素试验、正交试验及统计学分析。结合三重四极杆/复合线性离子阱质谱特有的多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式，建立了血液中喹诺酮类药物残留的分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
ACQUITY超高效液相色谱仪（美国Waters公司）; QTRAP 6500+三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪、Analyst和MultiQuant数据处理系统（美国SCIEX公司）;? Milli-Q Integral 5型超纯水仪（美国Merck Millipore公司）;? AB204-S型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）; CR 21N型高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）; MS3型涡旋振荡器（德国IKA公司）; KQ-600型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
甲醇、乙腈和四氢呋喃（色谱纯， 美国Fisher公司）; 正戊醇、正己醇、正辛醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇（百灵威科技有限公司）; 正庚醇和正壬醇（日本TCI公司）。11种喹诺酮类化合物标准物质：萘啶酸（99.5%）、恶喹酸（98.0%）、盐酸环丙沙星（95.0%）、达氟沙星（97.5%）、恩诺沙星（98.0%）、那氟沙星（99.0%）、司帕沙星（99.0%）、盐酸双氟沙星（97.5%）和盐酸莫西沙星（96.1%）购自德国Dr. Ehrenstorfer公司）; 培氟沙星（98.0%， 加拿大TRC公司）; 氧氟沙星（98.8%， 中国食品药品检定研究院）。11种喹诺酮类化合物的基本信息见表1。
2 实验方法
2.2.1 标准溶液的配制 准确称取11种喹诺酮类化合物标准物质各10 mg（精确至0.1 mg），分别用表1中对应的溶剂溶解并定容至10 mL，配制成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液。分别取11种喹诺酮类化合物标准储备溶液，配制成浓度为20 μg/mL的混合标准储备溶液，4℃保存。使用时以甲醇逐级稀释成系列浓度的标准工作溶液，现用现配。
2.2.2 超分子溶剂的制备 移取2.5 mL正己醇和8 mL四氢呋喃，迅速注入50 mL离心管中，加入29.5 mL水， 以420 r/min磁力搅拌3 min， 3000 r/min离心10 min，用注射器移取上层有机相于适宜容器中，4℃密封保存。
2.2.3 样品处理 采用活体取血法取血后立即移取0.1 mL血液样品，置于预先加入0.2 mL超分子溶剂的2 mL聚丙烯离心管中，涡旋振荡3 min，以5000 r/min离心10 min。移取上层液体50 μL于0.3 mL微量进样瓶中，加入50 μL甲醇混匀，过0.22 μm微孔滤膜后，待超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱测定。
2.2.4 分析条件 （1）色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）; 流速： 0.35 mL/min; 流动相： 0.15%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）。 （2）梯度洗脱程序 0～1.8 min， 10%～30% B; 1.8～2.2 min， 30%～90% B; 2.2～3.2 min， 90% B; 3.2～3.5 min， 90%～10% B; 3.5～5.0 min， 10% B; 柱温： 30℃; 进样量： 2 μL。（3）电喷雾质谱 电喷雾离子源; 正离子扫描; 离子源温度： 150℃; 喷雾电压： 5500 V; 气帘气流速： 30 psi， 雾化气流速： 60 psi， 脱溶剂气流速： 60 psi; 脱溶剂气温度： 600℃; 碰撞气设置： 高。（4）多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式（MRM-IDA-EPI） 扫描范围： m/z 50～415; 扫描速度： 20000 Da/s; 碰撞能量： （35±15） V。 11种喹诺酮类化合物的色谱-质谱分析参数见表2， 多反应监测色谱图见图1。
3 结果与讨论
3.1 超分子溶剂萃取条件的优化
3.1.1 单因素试验 （1）烷基醇种类 选用两亲性有机溶剂四氢呋喃分别与碳原子数C5～C12的烷基醇（正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、正十一醇和正十二醇）和水组合形成超分子溶剂，对11种喹诺酮类化合物进行萃取。如图2A所示，11种物质的萃取率随着烷基醇碳原子数的增加，整体呈现下降的趋势。反向胶束超分子溶剂萃取作用力主要包括烷基链的疏水相互作用和亲水头基的氢键作用。当烷基醇碳链较长时，疏水相互作用占优势，适合萃取极性小的物质; 当烷基醇碳链较短时，氢键作用占优势，适合萃取极性大的物质[21]。随着碳链长度的减小，超分子溶剂相给质子能力会随之提高，从而使分子间作用力增强，喹诺酮类化合物萃取率增加。总体而言，正己醇具有较好的萃取效果（萃取率为65.0%～113.1%），而正辛醇及碳链更长的烷基醇的萃取率较低。另一方面，喹诺酮类物质的化学结构中含有苯环、哌嗪环、环丙烷等结构，导致其空间位阻变大，短链烷基醇更容易克服空间位阻而与氢键位点结合，有助于提高萃取效率。因此， 最终选择正己醇用于后续优化试验。（2）烷基醇用量 保持超分子溶剂总体积为40 mL， 四氢呋喃用量为4 mL， 分别选取正己醇用量为1、1.5、2、2.5、3、3.5和4 mL进行了考察，结果见图2B。当正己醇用量大于2.5 mL时，样品可获得较好的萃取效率。（3）四氢呋喃用量 考察了四氢呋喃用量为2、4、6、8、10和12 mL（保持超分子溶剂总体积为40 mL及正己醇用量为2.5 mL）的萃取情况（图2C）， 结果表明， 四氢呋喃用量在8～10 mL时可获得较好的萃取效果。（4）涡旋时间 在超分子溶剂萃取过程中，通过涡旋振荡可以加速超分子溶剂和目标化合物之间充分混合，促进传质过程。比较了涡旋时间为1、2、3、5、7和9 min时的萃取效果（图2D），当涡旋时间在3～7 min时，可获得较理想的萃取效果。通过单因素试验确定各参数的大致优化范围后，通过正交试验对超分子溶剂萃取条件进行进一步优化。
3.1.2 正交试验 当同一因变量受到多种因素共同作用时，除需要考虑因素单独对试验结果的影响外，还应考虑不同因素之间可能存在的交互作用。超分子溶剂的结构、组成等主要受长链烷基醇或烷基酸、四氢呋喃和水比例的影响。其中，烷基醇或烷基酸的量影响超分子的结构，而四氢呋喃的量影响超分子的组成，并存在V=aX·ebY的函数关系（式中， a和b为与烷基醇或烷基酸种类有关的常数，V为超分子体积，X为烷基醇或烷基酸的用量，Y为四氢呋喃的百分比）[19， 20]。根据单因素试验结果，采用L8（23）正交表考察优化烷基醇种类、烷基醇用量和四氢呋喃用量三个因素以及它们之间的交互作用对11种喹诺酮类化合物的萃取效率的影响，每组条件做3次平行试验。正交试验因素水平表见表3。
11种喹诺酮类化合物的方差分析结果见电子版文后支持信息表S1，帕雷托图、主效应图和交互作用图分别见电子版文后支持信息图S1、S2和S3。综合单因素试验和正交试验结果，最终选用2.5 mL正己醇、8 mL四氢呋喃和29.5 mL水形成的超分子溶剂作为萃取溶剂。
3.1.3 主成分分析 采用SIMACA 13.0软件将主成分分析引入构效关系分析中，通过对方差分析结果p值进行统计分析（图3），探究了烷基醇种类、烷基醇用量、四氢呋喃用量等7种因子之间可能的关系规律。由主成分分析图和树状图可见，烷基醇种类A和四氢呋喃用量C被聚类在一起，表现出对萃取率近似的影响水平。而烷基醇用量B与交互因素AC位于同一类别，表现出了与另外两个单因素不同的影响水平。在交互因素中，AB和BC聚類在一起。三因素交互因素ABC在主成分分析图和树状图中均独立为一枝。总体而言， 7种因子之间具有较强的交互性和关联性，在条件优化时，需要根据实际情况综合考虑。
3.2 色谱条件的优化
3.2.1 色谱柱的选择 分别考察了具有不同选择性的色谱柱BEH C18、BEH Shield RP18、BEH phenyl、CSH Fluoro-phenyl和HSS C18的效果，结果表明，BEH C18色谱柱对11种氟喹诺酮类化合物呈现最佳的色谱峰形和信号响应。因此，选择BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）作为色谱柱。
3.2.2 流动相的选择 分别考察了反相色谱常用的有机相溶剂（甲醇、乙腈和甲醇-乙腈混合溶剂）与水、酸化水相（浓度为0.05%、0.1%、0.15%和0.2%的甲酸溶液）和碱性水相（浓度为0.01%、0.05%和0.1%的氨水溶液）组成的流动相体系。由于喹诺酮类药物为两性化合物，流动相pH值对目标化合物色谱行为影响较大。当在水相中加入氨水使其为碱性时，11种待测化合物在色谱柱上无保留; 而当在水相中加入甲酸使其为酸性时，色谱峰形和信号强度均明显改善。经综合比较，以乙腈-0.15%甲酸水溶液为流动相进行洗脱时，目标物可获得较好的色谱峰形、分离效果和信号响应。
3.3 质谱条件的优化
分别将11种待测目标化合物标准溶液（浓度均为20 ng/mL）以5 μL/min注入电喷雾离子源，各物质在正离子模式下可得到准分子离子峰[M+H]+。将其作为前体离子，再进行子离子扫描二级质谱分析，选择丰度较大的两个碎片离子，其中丰度较高的一个碎片离子作为定量离子，另一个作为辅助定性离子。分别对去簇电压、入口电压、碰撞能量、出口电压等质谱参数进行了优化。
三重四极杆/复合线性离子阱质谱既保留了串联四极杆的选择性和灵敏度优势，也具有线性离子阱增强二级碎片离子定性功能。采用多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式，单次进样可同时得到用于定量的多反应监测色谱图，以及用于辅助定性的不同碰撞能量复合二级质谱图。与传统的三重四极杆扫描模式相比，增强了二级碎片子离子扫描，有利于提高复杂样品基质中痕量目标化合物的准确定性能力。11种喹诺酮类化合物的增强子离子扫描质谱图见图4。
3.4 质谱裂解规律
与传统的串联四极杆质谱的子离子扫描方式不同，三重四极杆/复合线性离子阱质谱的增强型子离子扫描所得到的质谱图为低、中和高三种碰撞能量下采集得到的叠加质谱图，包含的碎片离子信息更为丰富。分析11种喹诺酮类化合物的增强子离子扫描质谱图可见，喹诺酮类化合物呈现前体离子失去H2O、CO2、CO、HF的中性丢失和哌嗪环断裂等裂解途径，裂解位点主要涉及到C-3位的COOH、C-4位的CO、C-6位的F和C-7位的哌嗪环等，而且一般脱去羧基后均有哌嗪环结构的两种重排反应，生成两种不同的碎片离子，即[M+H-CO2-C2H3NR2]+和[M+H-CO2-C3H6NR2]+（R2代表哌嗪环上可能连接的基团）。以环丙沙星为例，其裂解途径见图5。
3.5 方法学考察
3.5.1基质效应评估 由于血液基质复杂，可能会对检测结果的准确度造成干扰。对方法的基质效应进行了考察，11种待测喹诺酮类化合物的基质效应为92.6%～115.9%，表明采用超分子溶剂分散液液微萃取前处理方法，可较好地消除血液样品基质效应的影响。
3.5.2线性范围、检出限及定量限 在优化的条件下，测定一系列不同浓度的混合标准溶液，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，绘制标准工作曲线。结果表明，11种喹诺酮类药物在各自浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（R）大于0.998。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限和定量限，检出限为0.1～0.8 μg/L，定量限为0.4～2.0 μg/L（表4）。
表5列出了本方法与文献报道的检测方法的比较结果。与传统的液液萃取法和固相萃取法相比，本方法的有机溶剂用量明显减少，降低了对环境和操作人员的危害; 检测灵敏度与之相当或有所提高，但样品前处理步骤则更加简便快速，萃取与净化过程同步完成，避免了试验误差和样品损失。另一方面，本方法采用多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式，提高了复杂样品基质中痕量目标化合物的准确定性能力。
3.6实际样品分析
采用本方法对来自淡水鱼（鲫鱼、草鱼、鲤鱼、武昌鱼），家禽（鸡、鸭）和家畜（牛、猪）的共12个血液样品进行了检测，均未检出待测喹诺酮类药物残留。
以经测定不含待测物的血液样品为空白基质，分别添加低中高3个水平的混合标准溶液，按照本方法进行测定，每个水平平行操作6次，计算加标回收率。结果表明，11种喹诺酮类化合物的平均回收率为70.8%～115.2%， 相对标准偏差为3.0%～11.5%（表6）。
4 结 论
建立了超分子溶剂分散液液微萃取结合超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱测定血液中11种喹诺酮类药物残留的分析方法，通过单因素和正交试验考察了影响萃取效果的烷基醇种类与用量、四氢呋喃用量等关键因素，并进行了相关的统计学分析。在最佳条件下，利用多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描复合模式测定11种待测化合物的检出限为0.1～0.8 μg/L，定量限为0.4～2.0 μg/L; 在低中高3个加标水平下的平均回收率为70.8%～115.2%，相对标准偏差为3.0%～11.5%。
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Determination of 11 Kinds of Quinolones Residues in Blood
by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Hybrid
Triple Quadrupole-Linear Ion Trap Mass Spectrometry
WANG Chun1，2， YUAN Wen-Feng1， GU Chuan-Kun2， WANG Chang-Hai*2， MA Qiang
1（Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100176， China）
2（College of Resources and Environmental Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）
Abstract A method for determination of 11 kinds of quinolones residues in blood was developed using supramolecular solvent-based dispersive liquid-liquid microextraction followed by ultra-performance liquid chromatography-hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. The supramolecular solvent was prepared with hexanol as extraction solvent and tetrahydrofuran as dispersing agent for dispersive liquid-liquid microextraction of blood samples. The main parameters such as the composition and amount of supramolecular solvent and vortex time were systemically investigated by both single factor and orthogonal experiments in combination with statistical analyses. Chromatographic separation was performed on a Waters ACQUITY UPLC BEH C18 column （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） with mobile phases of acetonitrile and 0.15% aqueous formic acid solution. Data acquisition was carried out in multiple reaction monitoring-information dependent acquisition-enhanced product ion mode for qualitative and quantitative analyses. The 11 kinds of quinolones exhibited good linearity in their respective linear ranges， with correlation coefficients of better than 0.998. The limits of detection and quantitation were in the range of 0.1-0.8 μg/L and 0.4-2.0 μg/L， respectively. The average recoveries at low， medium， and high spiked levels ranged from 70.8% to 115.2% with relative standard deviations of 3.0%-11.5% （n=6）.
Keywords Ultra-performance liquid chromatography-hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry;? Supramolecular solvent;? Dispersive liquid-liquid microextraction;? Quinolones
