一步法合成聚乙烯亚胺保护的荧光银纳米簇用于甲硝唑检测
刘梦旋 尹建行 孟磊 徐娜
摘?要?甲硝唑（MNZ）是普遍使用的一种硝基咪唑类抗生素，多用于治疗厌氧菌引起的感染或动物饲料的添加剂，残留过量时会产生致畸、致癌等作用，因此准确检测MNZ十分必要。本研究利用微波技术，采用一步法成功合成了聚乙烯亚胺保护的银纳米簇（AgNCs@PEI）荧光探针，所合成的AgNCs在高离子强度及长时间光照下具有良好的荧光稳定性。AgNCs配体中的大量氨基官能团与MNZ中咪唑环内N原子之间的氢键作用，使二者形成稳定的非辐射基态配合物，导致AgNCs荧光强度下降，基于此建立了检测MNZ的荧光分析方法。线性范围为0.1～200 μmol/L，检出限为0.038 μmol/L（S/N=3），方法具有良好的选择性。将此荧光探针应用于人尿液中MNZ的测定，回收率为95.8%～103.4%，相对标准偏差小于4.3%。
关键词?聚乙烯亚胺; 银纳米簇; 甲硝唑; 荧光探针
1?引 言
甲硝唑（MNZ）是硝基咪唑类抗生素中的一种，主要用于临床治疗和预防厌氧菌引起的感染疾病 [1～3]; 同时还具有促进牛、猪及家禽生长和提高饲料喂养效率的作用，也是一种常用的动物饲料添加剂。当MNZ的累积剂量或残留量超过一定数值时，则具有潜在的致畸、致癌、致突变作用和遗传毒性 [4～6]。 因此开发高选择性、高灵敏检测MNZ的方法十分必要。
目前，检测MNZ主要方法有高效液相色谱法[7，8]、高效液相色谱-质谱法[9]、 电化学分析法[10，11]和气相色谱法[12，13]等，但这些方法大多存在灵敏度低、过程繁琐、成本高等缺点。相比于传统的检测方法，基于荧光探针的分析方法具有灵敏度高、快速、廉价、简单以及实用性强等特点。银纳米簇（AgNCs）作为一种新型的荧光纳米材料，因其具有量子产率高、发射波长可调、生物相容性好等优点，被广泛用于生物成像、分析检测、催化等领域[14～16]。合成AgNCs的传统方法有水热法[17]、化学刻蚀法[18]等，但这些方法仍存在AgNCs粒径均匀性较差、稳定性不佳、制备过程复杂等问题。微波合成法利用其介电热效应将电磁能转化为热能，与传统合成方法相比，该方法所制备的纳米材料具有尺寸均一、物理化学性质稳定、制备过程易于控制且合成时间较短等特点[19，20]。
本研究采用一步微波法合成了一种基于聚乙烯亚胺保护的银纳米簇（AgNCs@PEI），合成方法简单、快速、成本低。制备的AgNCs@PEI稳定性良好，可作为荧光探针对痕量MNZ进行检测，方法灵敏度高、选择性好。
2?实验部分
2.1?仪器与试剂
T20型透射电子显微镜 （美国FEI公司）; ?LS-55荧光分光光度计（英国PE公司）; ?UV-2200双单色器双光束紫外可见分光光度计 （北京瑞利分析仪器公司）; FE20型pH计 （上海梅特勒-托利多仪器有限公司）; ?MAS-II Plus常压微波合成/萃取反应工作站（上海新仪微波化学科技有限公司）;
聚乙烯亚胺（PEI，MW 10000）、 MNZ、谷胱甘肽（GSH）（上海阿拉丁试剂公司）; ?AgNO3（国药集团化学试剂有限公司）; 抗坏血酸（AA）、牛血清蛋白（BSA）以及20种天然氨基酸（Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg、Phe、Gly、Gln、Glu、Thr、Trp、Ser、Ala、Asp、Lys、Leu、Asn、Tyr、His）（南京奥多福尼生物科技有限公司）。所用试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水。
所用缓冲溶液为Briton-Robinson（BR）缓冲溶液，由一定比例的0.04 mol/L的磷酸、硼酸、醋酸混合而成，用NaOH溶液调节pH值分别为3～11。
2.2?实验方法
2.2.1?AgNCs@PEI的合成?参考文献[21]的方法并稍作改进。将3.75 μmol/L PEI溶于15 mL超纯水，加入3.75 μmol/L AgNO3，搅拌2 h后，用1.0 mol/L的HCl或NaOH调节混合体系的pH值为3～11; 最后加入AA，将混合溶液置于微波合成仪中，在60℃、100 W条件下反应一段时间，所得反应液用0. 22 μm 滤膜过滤，于4℃保存，备用。
2.2.2?MNZ的检测?800 μL不同浓度的MNZ 溶液分别与200 μL AgNCs@PEI、1000 μL BR缓冲液（pH 6）混合，静置 2 min，测定反应体系的荧光光谱，激发波长455 nm。
2.2.3?选择性测试?配制 10 mmol/L Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl、CO23、HCO3、HPO24、H2PO4、PO34、葡萄糖与20种天然氨基酸（Val，Met，Cys，Ile，Pro，Arg，Phe，Gly，Gln，Glu，Thr，Trp，Ser，Ala，Asp，Lys，Leu，Asn，Tyr，His）溶液。取800 μL不同物质溶液和200 μL AgNCs@PEI、1000 μL BR缓冲液（pH 6）混合，静置2 min，测定荧光光谱，激发波长455 nm。
2.2.4?实际样品分析?尿液来源于健康志愿者。在200 μL尿液中添加800 μL不同浓度的MNZ，与200 μL AgNCs@PEI原液、800 μL BR缓冲液（pH 6）混合，静置孵育2 min，测定荧光光谱，激发波长455 nm。
3?结果与讨论
3.1?AgNCs@PEI的表征
图1A为AgNCs@PEI的透射电镜图，可以看出纳米颗粒的分散性高且粒径均一，平均粒径约为2.6 nm，其晶面间距为0.236 nm（图1B），为Ag（111）晶面[22]，表明成功合成了AgNCs@PEI。在AgNCs@PEI的吸收光谱中，在350 nm附近存在一个较宽的吸收峰（图1C），但没有表面等离子体共振（SPR）吸收带，表明不存在大的Ag纳米颗粒。图1D为AgNCs@PEI的荧光激发与发射光谱，最大激发波长为455 nm，最大发射波长为545 nm，说明AgNCs@PEI具有较大的斯托克斯位移（～90 nm）。如图1E所示，AgNCs@PEI的XPS谱图中Ag的特征峰表明，AgNCs主要由Ag0和Ag+組成，簇表面Ag+的存在，有利于电子由PEI向AgNCs转移，从而产生荧光[23]。
3.2?AgNCs@PEI合成条件优化
3.2.1?合成反应时间对荧光强度的影响?保持其它实验条件不变，在不同合成反应时间下制备AgNCs@PEI，测定其荧光光谱。实验结果表明，反应时间为15 min时，所制备的AgNCs@PEI荧光强度最高（图2A）。相比于文献[21]中采用的溶液搅拌方法（～48 h）， 合成时间大幅缩短，说明微波方法可以有效提高合成效率。
3.2.2?pH值对荧光强度的影响
用1 mol/L的HCl或NaOH分别将PEI和AgNO3混合溶液的pH值调至3、5、7、9和11，然后向其中加入37.5 μmol/L AA，在微波合成仪中反应15 min，得到不同的AgNCs@PEI。由图2B可知，合成溶液的pH =5时，得到的AgNCs@PEI的荧光强度最高。
3.2.3?Ag+与AA的摩尔比对荧光强度的影响?保持其它实验条件不变，在Ag+与AA的摩尔比分别为1∶1、1∶5、1∶10和1∶15时，采用微波合成仪合成不同的 AgNCs@PEI。结果显示（图2C），当Ag+与AA的摩尔比为1∶10时（3.75 μmol/L AgNO3，37.5 μmol/L AA），AgNCs@PEI的荧光强度最高。此结果与文献[21]一致。
3.3?AgNCs@PEI的稳定性
在高离子强度下， 考察了AgNCs@PEI的稳定性和抗光漂白性能。图3A为AgNCs@PEI在 545 nm处荧光强度随NaCl浓度变化的柱状图，可见AgNCs@PEI荧光强度随NaCl浓度的变化较小，说明AgNCs@PEI在高浓度离子溶液中具有较好的荧光稳定性。由图3B可知，AgNCs@PEI经455 nm （光强度 750 a.u.）光照30 min后， 其荧光强度基本保持稳定，表明合成的AgNCs@PEI具有良好的光稳定性。在不同pH值下，AgNCs@PEI在545 nm的荧光强度如图3C所示，在酸性和中性条件下的荧光强度较高。
3.4?AgNCs@PEI对MNZ的检测
3.4.1?可行性测试及检测条件的优化?在制备的AgNCs@PEI中分别加入200和500 μmol/L MNZ，荧光光谱如图4A所示。结果表明，MNZ能够淬灭AgNCs@PEI的荧光，且随着MNZ浓度增加，AgNCs@PEI荧光猝灭程度增大。图4B为AgNCs@PEI对MNZ（500 μmol/L）的荧光响应时间，可见荧光强度随时间的延长而下降，在1 min后趋于稳定。为了得到稳定的荧光响应信号，后续实验均在孵育 2 min后进行测试。此外，考察了检测体系的pH值对荧光响应的影响，分析了不同pH值下MNZ对AgNCs@PEI荧光的猝灭效果。如图4C所示，在体系中加入500 μmol/L MNZ，AgNCs@PEI的荧光强度在pH=6时荧光猝灭程度最高，因此选择检测MNZ体系的pH=6。
3.4.2?AgNCs@PEI对MNZ的分析性能?不同浓度MNZ存在时， AgNCs@PEI的荧光光谱图如图5A所示。随着MNZ浓度增加，AgNCs@PEI在545 nm处的荧光强度随之下降，在1500 μmol/L时基本完全猝灭。在545 nm处的相对荧光强度（F0-F，F0和F分别表示加入MNZ前后的探针荧光强度）与MNZ浓度在两段浓度范围内均呈良好的线性关系（图5B）。在15～200 μmol/L范围内，线性方程为F0-F=1.2644CMNZ +66.5298（R2=0.9946）; 在 0.1～15 μmol/L范围内，线性方程为F0-F=4.3308CMNZ+13.7640（R2=0.9916），检出限（S/N=3）為0.038 μmol/L。与文献报道的检测MNZ的纳米荧光探针相比，本方法的检出限及线性范围与其它方法相当或者更优（表1）。
3.4.3?AgNCs@PEI对MNZ荧光响应的选择性分析?考察了AgNCs@PEI对不同离子及氨基酸的抗干扰性能。在分别含有500 mmol/L MNZ和其它分析物的检测体系中，只有MNZ能够明显猝灭AgNCs@PEI的荧光，而其它分析物对AgNCs@PEI荧光响应变化值<6.5%（图6），说明基于AgNCs@PEI探针检测MNZ具有良好的选择性。
3.4.4?检测机理研究?具有较大斯托克斯位移的荧光纳米簇，其荧光的产生主要来源于以金属为中心的三线激发态辐射弛豫，而非金属簇内核量子化束缚所引起的[29]。这种弛豫过程与纳米簇的保护配体有关，例如配体分子内的振动和转动常导致三线激发态非辐射弛豫的发生。因此，研究加入MNZ前后AgNCs@PEI配体的微观变化，有助于探究其荧光猝灭的机理。AgNCs@PEI和MNZ混合物的紫外-可见吸收光谱如图7A所示，MNZ加入AgNCs@PEI 后， 在323 nm处出现一个新的吸收峰（曲线c），且此特征峰较MNZ的特征峰（318 nm， 曲线a）发生相对红移。AgNCs@PEI吸收光谱的改变可能是由于MNZ咪唑环内N原子（具有非共用电子对）易与PEI中大量氨基官能团产生较强的氢键作用，形成稳定的配合物。此配合物使PEI分子内的振动及转动加剧，导致三线激发态电子发生非辐射复合及荧光猝灭。此外，由于MNZ中含有吸电子能力很强的硝基官能团，也可能导致激发态电子发生电荷转移而出现荧光猝灭。对AgNCs@PEI加入MNZ前后的荧光寿命进行分析的结果如图7B所示，寿命拟合数据见表2，加入MNZ前后的荧光寿命基本未发生变化，说明MNZ并未影响AgNCs@PEI的光电子辐射弛豫过程[30]。
3.5?实际样品分析
采用本方法检测人尿样中的MNZ。尿样中未检出MNZ。在尿样中分别添加10.0、50.0和100.0 μmol/L MNZ标准样品，采用本方法进行测定，加标回收率在95.8%～103.4%之间，相对标准偏差 （RSDs） 均低于4.3%（表3），表明AgNCs@PEI具有良好的应用潜能。
4?结 论
合成了基于聚乙烯亚胺保护的银金属纳米簇荧光探针（AgNCs@PEI），能够在高离子强度环境中且长时间光照下稳定存在，合成方法简便、快速、成本低。AgNCs@PEI配体中的大量氨基官能团与MNZ咪唑环内N原子（具有非共用电子对）可产生较强的氢键作用，形成稳定的非辐射配合物，导致AgNCs@PEI荧光的猝灭，基于此建立了MNZ的荧光检测方法。本方法具有检出限低、灵敏度高、重现性好的特点， 并用于尿液中MNZ的检测。本方法有望拓展到疾病诊断、水质分析等领域。
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