新型比色荧光双通道探针用于硫化氢的检测

    王肖莉 姚猛 李引 魏超 王美

    

    

    

    摘?要?以7-硝基苯并呋咱（NBD）为荧光团，经一步有机合成，高产率制备比色荧光双通道探针，用于检测环境和体内硫化氢（H2S）的含量。以无水Na2S为H2S供体，考察了探针的选择性、灵敏性等性能。结果表明，探针荧光强度与H2S浓度在5～50 μmol/L浓度范围内呈良好的线性关系，检出限为0.125 μmol/L，同时反应溶液由无色变为紫色。采用MTT法测试探针的细胞毒性，结果表明，在探针浓度低于50 μmol/L条件下，细胞存活率高于90%。激光扫描共聚焦显微成像结果表明，探针可靶向细胞溶酶体，可对溶酶体内H2S进行成像研究。

    关键词?硫化氢; 比色检测; 荧光探针; 细胞成像

    1?引 言

    硫化氢（H2S）是一种无色且具有臭鸡蛋气味的气体，一般由工业中含硫物质非完全燃烧产生，被认为是一种有毒环境污染物。近年的研究发现，H2S是生命体内一种重要的内源性气体信号分子，参与多种重要的生理过程[1～4]，H2S浓度异常与许多疾病有关，如阿尔茨海默氏症、唐氏综合症、糖尿病和肝硬化等[5，6]。但是，其在体内的潜在分子机制尚不明确[7，8]。因此，基于H2S在环境和生命体内的重要作用，开发灵敏有效的分析方法具有重要的意义[9]。

    传统的H2S检测方法包括吸收光谱法、电化学法、气相色谱法和硫沉淀法等[10～13]，而光学探针法发展迅速。其中，比色法可不借助昂贵的仪器设备，直接对目标物裸眼分析; 荧光探针法选择性好、灵敏度高，可对生物样本（细胞、组织和活体等）内目标物进行实时荧光成像研究。基于H2S的化学性质（还原性、亲核性等），研究者发展了多种反应型H2S荧光探针[14～16]，包括还原型（芳香叠氮/硝基/羟胺还原为胺基）[17～20]、亲核型（亲核取代[21，22]、亲核加成/双亲核加成[23，24]）、形成CuS沉淀型[25]等。近年来，虽然已报道了大量H2S荧光探针，但是开发兼具制备简便、选择性好、灵敏度高等优点，并能够实现比色和熒光双通道检测H2S的优良的探针分子，用于检测环境和生物样品中的H2S，仍然是当前的研究热点。

    2013年，本研究组[26]和Pluth研究组[27]分别发现7-硝基苯并呋咱（NBD）胺可与H2S发生亲核取代反应，其产物NBD-SH可用于比色检测H2S。基于此，利用多种光物理扰动原理，构建了系列选择性检测H2S的比色荧光双通道探针[28～30]。进一步利用NBD优秀的荧光性质，本研究组[31]和易龙研究组[32]分别构建了以7-羟基香豆素连NBD为骨架结构的比例计量型H2S荧光探针，实现了细胞线粒体和溶酶体内H2S的比例成像研究。

    考虑到上述探针分子需要多步有机合成进行制备，本研究以NBD为荧光团，吗啉为溶酶体靶向基团，经一步有机反应，设计合成了新型比色荧光双通道H2S探针NBD-M。此探针本身具有荧光，与H2S反应后的产物NBD-SH在水溶液中荧光较弱，因此，可产生由开到关的荧光变化; 同时，利用产物NBD-SH的颜色变化可比色检测溶液中H2S。考察了探针的溶酶体靶向的功能，并测试了探针检测细胞溶酶体内H2S的能力。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    Brucker 600核磁共振仪（美国Brucker公司，TMS为内标）; Varian 7.0 T FTICR-MS质谱仪、UV-3600型分光光度计（美国Agilent公司）; F-7000型荧光光谱仪（日本日立公司）; PHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）; ZF-7型三用紫外分析仪、X-4显微熔点仪（上海精密仪器仪表有限公司）。4-氯-7-硝基苯并呋咱和吗啉（阿拉丁试剂有限公司）; 其它试剂均购于天津光复试剂公司。所用试剂均为市售分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

    2.2?探针NBD-M的合成

    将200 mg （1.00 mmol） NBD-Cl和91 mg （1.05 mmol）吗啉溶解于10 mL二氯甲烷，向其中加入209 μL （1.50 mmol）三乙胺，室温反应1 h后，加入10 mL水，萃取，有机相加入无水Na2SO4干燥，蒸除溶剂，所得粗品用硅胶柱分离（二氯甲烷-甲醇，100∶1，V/V）得淡红色固体，产率90%。熔点：147.2～148.5℃。1H NMR （DMSO-d6，600 MHz），δ （ppm）： 8.51 （d，J=9.0 Hz，1H），6.68 （d，J=9.0 Hz，1H），4.13～4.12 （m，4H），3.85～3.83 （m，4H）。 13C NMR （DMSO-d6，151 MHz），δ （ppm）： 14539，14475，14473，13621，12136，10342，6567，4947。 MS （ESI+） calcd for [M+H+]?341.1，found 341.2。探针NBD-M的合成路线见下式。

    2.3?光谱测试

    配制2 mmol/L探针的DMSO溶液，在室温下、磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4，0.02 mol/L）中进行光谱测试，探针浓度为 10 μmol/L，激发波长为490 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm。选择性测试所需各种潜在干扰物质均溶于纯PBS，测试浓度为200 μmol/L。

    2.4?细胞成像

    细胞培养实验方法和条件参见电子版文后支持信息。HeLa细胞接种于35 mm细胞成像专用玻底培养皿，成像细胞密度为2×104。加入NBD-M （10 μmol/L）和商品化溶酶体定位探针Lyso-Tracker Red （20 nmol/L）共孵育30 min，用PBS洗涤3次后，进行共定位成像研究。探针NBD-M荧光通道激发波长为488 nm，发射波长范围500～550 nm; Lyso-Tracker Red荧光通道激发波长为546 nm，波长采集范围590～640 nm。

    3?结果与讨论

    3.1?探针的光谱性质

    探针的荧光性质是探针荧光检测和成像的基础。考察了不同溶剂对探针紫外吸收和荧光发射光谱的影响。随着溶剂极性增加，探针的最大紫外和荧光发射均发生红移（电子版文后支持信息表S1）。如图1所示，在PBS中，探针的最大紫外吸收和荧光发射分别为496和576 nm，斯托克斯位移高达80 nm，在实际应用中可有效避免激发光对检测光谱信号的干扰。

    3.2?探针对H2S的识别性能研究

    在PBS （ 0.02 mol/L，pH 7.4）溶液中，探针的最大紫外吸收峰强度在探针浓度0～4.0 × 104 mol/L范围内线性关系良好（r=0.9993），表明探针具有良好的水溶性（电子版文后支持信息图S2）。如图2所示，将探针溶液（ 10 μmol/L）和新配H2S 溶液（200 μmol/L）混合，30 min后反应体系的荧光信号基本稳定。计算所得探针与H2S反应的假一级反应动力学常数（kobs）约为2.1 × 103 s1，二级反应动力学常数（k2）为10.5 L/（moL·s），与其它NBD基亲核取代型H2S荧光探针的常数的数量级相当[18，26]，表明探针可作为一种快速检测H2S的荧光关闭型探针。

    Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、F、Cl、Br、I、NO3、SO24、NO2、HClO、Vc、KO2、SO23、H2O2、Hcy、Cys、GSH、H2S），测试其荧光发射光谱（λex=490 nm）。如图3所示，H2S可使探针的荧光显著降低，而其它物质不会明显改变探针的荧光强度，表明探针NBD-M对H2S的荧光响应具有较高的选择性。

    为了评估探针对H2S的检测灵敏性，进行了荧光滴定实验。向探针溶液（10 μmol/L）中依次加入不同浓度（0～100 μmol/L）的新配H2S溶液，孵育15 min，探针与576 nm處的最大发射峰荧光强度逐渐增强（图4Α）。如图4B所示，在5～50 μmol/L浓度范围内，H2S的浓度与探针的荧光强度呈现良好的线性关系，其线性方程为y=266.13-3.43x （r=0.9942），检出限为0.125 μmol/L （S/N=3），与已报道文献相当[26]。上述结果表明，探针NBD-M可定量检测H2S的浓度，具有较高的灵敏度。

    探针与H2S反应后，探针最大紫外吸收峰发生明显红移（电子版文后支持信息图S3）。文献报道，探针与H2S反应后，产物NBD-SH具有明显的颜色[26，27]。向探针溶液（10 μmol/L）中加入0、10、20、30、40、50、75 和100 μmol/L的新配H2S溶液，室温孵育5 min后，可明显观察到溶液由淡黄色变为紫色，并且随着H2S加入量的增加，溶液紫色逐渐加深（图5）。基于探针溶液的颜色变化与不同H2S浓度之间的相关性，可简便地半定量检测水样中20 μmol/L H2S。因此，探针NBD-M可实现对H2S的比色和荧光双通道检测。

    3.3?探针对H2S的识别机制研究

    为了研究探针与H2S的识别机制，向探针溶液中加入等摩尔数的H2S，测试了探针与H2S反应前后的核磁共振氢谱。探针1位和2位芳香氢的化学位移分别为6.67和8.51 ppm，与H2S反应后，此位置芳香氢的化学位移分别7.00 ppm和8.07 ppm移动到7.42 ppm。结合探针与H2S反应的紫外吸收光谱和溶液颜色变化，推测探针与H2S发生如图6所示的亲核取代反应。

    3.4?探针对细胞内H2S荧光成像研究

    荧光关闭型荧光探针已被报道用于内源性H2S的成像研究[33～35]。利用四唑盐（MTT）比色法，对探针的细胞毒性进行评价，发现探针在浓度低于50 μmol/L时，细胞存活率高于90%，可用于细胞实验研究（电子版文后支持信息图S4）。

    一些小分子胺类基团（如吗啉、N，N-二甲基胺等）本身具有碱性，含有此类结构的荧光探针能够选择性地积累在弱酸性细胞器，实现溶酶体定位功能。利用商品化溶酶体定位探针（Lyso-Tracker Red）进行细胞器共定位成像研究。如图7所示，向HeLa细胞加入含有20 nmol/L共定位探针Lyso-Tracker Red和10 μmol/L探针NBD-M的培养基，共孵育15 min，可观察到两个探针光谱重叠良好，共定位皮尔森相关系数为0.93[36]，表明探针具有良好的溶酶体定位能力。

    利用探针对细胞内H2S进行荧光成像研究。如图8所示，HeLa细胞在含有10 μmol/L探针的培养基中孵育15 min，可观察到明显的黄色荧光（图8A）; 先孵育100 μmol/L H2S 30 min，再孵育探针15 min，黄色荧光明显降低（图8B）; 先孵育200 mol/L H2S 30 min，再孵育探针15 min，黄色荧光基本完全消失（图8C）。荧光成像实验表明，探针NBD-M能够用于HeLa细胞溶酶体内H2S的成像研究。

    4?结 论

    合成了一种新型比色-荧光双通道探针NBD-M，能够高选择性和高灵敏识别H2S。探针与H2S反应后，溶液颜色由无色逐渐变为紫色，能够裸眼检测含20 μmol/L H2S的水样，具有一定的应用前景。此探针能够靶向HeLa细胞溶酶体，可用于细胞内H2S的成像研究。

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