紫外线辐射对海带配子体克隆的影响

    赵聚萍 罗世菊 李晓捷 王利芹

    

    

    

    摘 要：为确定海带（Saccharina japonica）配子体紫外线辐射的适合剂量范围，利用紫外线对东方海洋种质库保存的2个海带配子体克隆系进行辐射试验。通过三次预试验，辐射条件设置为：辐射距离12 cm，辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、90、120 s。结果显示：辐射时间10、20 s配子体细胞未发生明显变化，但受辐射影响，克隆约2个月的时间不生长;辐射时间30 s细胞存活率约为50%～55%;随着辐射时间的增加，细胞死亡增多;辐射时间120 s下，两个克隆系只有极个别细胞存活。在辐射距离12 cm时，辐射时间10～120 s作用范围内，雄配子体耐受力明显高于雌配子体。

    关键词：诱变育种;紫外线辐射;海带（Saccharina japonica）;配子体

    海带（Saccharina japonica）属于冷水性大型海藻，是我国海水养殖的重要经济藻类，在我国养殖面积很广。从上世纪50年代开始，我国开始进行海带大规模人工养殖，经过几十年的发展，目前已经形成了较为成熟的养殖技术体系和较为完善的产业链[1]。配子体克隆技术的建立，使海带的种质得以长久保存，并且通过配子体杂交技术培育海带新品种，解决了传统育苗育种选育周期长、优良性状容易退化等问题。为了丰富育种素材，采用物理诱变等方式诱导海带配子体产生变异，能缩短获得优良变异植株的时间。

    海带常规育种方法有定向选择、诱变、杂交结合连续自交等。由于常规育种方法自然突变的发生率低[2]，因此经常利用物理、化学等诱变手段，提高突变率，加速育种进程。紫外线辐射是物理诱变的一种，具有操作安全、简单、对环境污染小等优点。紫外线辐照影响DNA的复制和转录，引起基因突变和染色体畸变，产生各种各样的变异[3]。目前，在农业生产上，已有多个利用紫外线辐射诱变育种的报道[4-7]。

    本研究利用紫外线对种质库保存的2个配子体克隆系进行4次辐射试验，通过观察辐照后海带配子体细胞状态及细胞死亡情况，判断紫外线辐射对海带配子体的作用范围，以确定海带配子体紫外线辐射的适合剂量范围，为丰富育种素材，进一步进行海带紫外线辐射育种提供依据。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料

    试验选用的材料为山东东方海洋科技股份有限公司海藻实验室中保存的海带配子体克隆RC571104004（♀）、RC571104005（♂）共2个克隆系。

    1.2 试验方法

    将2个克隆系的克隆分别用厚玻璃板压磨，将压磨后的克隆经400目筛绢过滤，得到1～4个细胞的细胞段滤液，倒入直径9 cm的培养皿中，预培养5～7 d。用预培养后的克隆进行试验。将15 W紫外线灯管固定在低温冷藏箱内，冷藏箱温度为8～12 ℃。将培养皿内的水倒掉，放在紫外线灯管下辐射，辐射完成后，加入低温培养液，将培养皿放入培养箱内暗光下培养，培养箱温度为8～12 ℃。65 d后，转入弱光下培养，光照强度为6～10 μmol·m-2·s-1，光照周期为L∶D=24 h∶0。每天换水、镜检一次，观察克隆状态。

    试验首先对试验辐射距离与辐射时间进行探索，预试验的辐射距离与辐射时间见表1。预试验结果表明在辐射距离为6 cm和12 cm;辐射时间为240～600 s的情况下，4～5 d时绝大部分细胞死亡;40～45 d时试验组细胞全部死亡。当辐射距离为12 cm;辐射时间为60、120 s的情况下，9 d时部分细胞开始死亡;25 d时绝大部分细胞死亡，但克隆系之间与辐射组别之间均无差异;60 d时试验组的存活细胞开始逐渐恢复生长。通过这三次预试验，重新设置试验：辐射距离为12 cm，辐射时间为：10、20、30、40、50、60、90、120 s，以不辐射的样本为对照。试验每个辐射剂量设3个平行，对照组3个平行。

    2 结果

    辐射完成后，每天镜检辐射克隆。不同镜检时间观察对照组均生长正常，没有明显变化。辐射组前期镜检没有明显变化;15 d镜检部分辐射组出现死亡;50 d鏡检各辐射组死亡情况趋于稳定。辐射时间30 s组，雌、雄两个克隆系细胞存活率均约为50%～55%;90 d镜检各辐射剂量存活细胞开始生长。♀♂两个克隆系不同镜检时间镜检结果见表2，♀♂各辐射剂量存活情况见表3，♀♂各辐射剂量存活情况趋势图见图1。

    3 讨论

    试验材料的处理：先将海带配子克隆利用厚玻璃板压磨，过滤，得到1～4个细胞的细胞段滤液，预培养5～7 d，待克隆附着牢固，细胞状态恢复后进行辐射。首先试验考虑到紫外线辐射的穿透性，避免因克隆细胞重叠，照射不到，影响试验结果;其次待克隆状态恢复后进行辐射，避免因压磨对克隆细胞的损伤影响试验结果。

    从试验结果可以看出，利用15 W紫外线灯管对海带配子体克隆进行辐射，辐射距离为12 cm时，辐射时间10、20 s配子体细胞未发生明显变化，但受辐射影响，克隆约2个月的时间不生长;辐射时间30 s细胞存活率约为50%～55%;随着辐射时间的增加，细胞死亡增多;辐射时间120 s下，两个克隆系只有极个别细胞存活。

    辐射时间长时，雌、雄两个克隆系均没有存活细胞，雌、雄配子体没有明显区别;在辐射距离12 cm时，辐射时间10～120 s作用范围内，海带雄配子体受辐射后表现晚于雌配子体，且细胞存活率高于雌配子体，因此海带雄配子体对紫外线的耐受力明显高于雌配子体。紫外线辐射时冷藏箱温度为8～12 ℃，进行试验操作时动作迅速，辐射完成后加入低温培养液等均为减少人为操作对试验结果的影响。另外，海带配子体自身的状态、外部环境等因素可能对试验结果有一定的影响。

    紫外线辐射可能诱导海带配子体产生大量变异，对辐射后的海带配子体克隆进行扩增培养、海带配子体克隆育苗，期待能在较短时间内获得具有优良性状的变异植株，分离、保存与优良性状相关的新基因;还可以结合海带配子体克隆细胞杂交技术获得数量多、种类多的突变植株[8]。同时，利用海带配子体克隆培养方法分离和培养目标植株的配子体细胞，可以作为新的海带遗传资源进行保存，丰富海带种质资源库。另外，紫外线辐射操作安全、简单，在实验室内就可以进行，不需要特殊仪器，因此还可以尝试对海带孢子体、海带幼苗进行辐射，观察其突变情况，以期获得新的具有优良性状的变异植株。

    參考文献：

    [1] 刘福利，王飞久，孙修涛，等.分子育种及其在海带育种中的研究进展[J].海洋科学，2012，36（9）：128-134.

    [2] DRAKE J W，CHARLESWORTH B，CHARLESWORTH D，et al.Rates of spontaneous mutation[J]. Genetics，1998，148（4）：1667-1686.

    [3] 张跃群，陆德祥，王勇军.紫外线辐照对3种海洋微藻蛋白质含量的效应[J].安徽农业科学，2009，37（20）：9 350-9 351.

    [4] 周玉娇，李亚军，费小雯，等.小球藻紫外线诱变及高含油藻株筛选[J].热带作物学报，2010，31（12）：2124-2129.

    [5] 张学成，时艳侠，孟振.小球藻紫外线诱变及高产藻株筛选[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2007，37（5）：749-753.

    [6] 黄瑞芳，刘广发，周韬，等.耐高温巴氏杜氏藻突变株的诱变和鉴定[J].厦门大学学报（自然科学版），2006，45（2）：272-275.

    [7] 石淑稳，吴江生，牛勤思.甘蓝型油菜小孢子离体诱变-紫外线对小孢子胚状体再生的影响[J].核农学报，2007，21（1）：17-19.

    [8] 李晓捷，张立楠，王振华，等.一种海带重离子辐射诱变育种新方法：CN103766214B [P].2014-05-07.

    Effects of ultraviolet radiation on the gametophyte clones of Saccharina japonica

    ZHAO Juping， LUO Shiju， LI Xiaojie， WANG Liqin

    （Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd.， National Algae and Sea Cucumber Engineering and Technique Research Center， Shandong Algae and Sea Cucumber Technology Innovation Center， Shandong Key Laboratory of Genetic Improvement & Efficient Culture of Marine Alage， Yantai 264003， China）

    Abstract：Four ultraviolet radiation experiments were carried out on two gametophyte clones of Saccharina japonica， preserved in the germplasm bank of Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd. to screen the suitable dose range of ultraviolet radiation for mutation breeding. After three pre-tests， the experiment was set 12 cm for radiation distance， and 10 s， 20 s， 30 s， 40 s， 50 s， 60 s， 90 s， 120 s for radiation time， respectively.The results showed that no cell survived when the radiation distance was 6 cm. The gametophyte cell did not change significantly for 10 s and 20 s when the radiation distance was 12 cm， but the clones did not grow during a period of approximately 2 months; the survival rates of clones were about 50%～55% for 30 s; the number of death cells increased with the increase of radiation time; only a few cells survived for 120 s. The tolerance of male gametophytes was significantly stronger than that of female gametophytes when the radiation distance was 12 cm and the radiation time was 10～120 s.

    Key words：mutation breeding; ultraviolet radiation; Saccharina japonica;gametophyte

    （收稿日期：2021-02-22;修回日期：2021-03-23）

    基金项目：国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2018YFD0901500）;现代农业产业技术体系专项资金（CARS-50）;烟台市科技计划项目（2018LJRC067）;山东省重点实验室专项建设计划（SDKL2017009）;山东省现代农业产业技术体系建设专项资金（SDAIT-26-11）。

    作者简介：赵聚萍（1983-），女，工程师，硕士，研究方向：海藻育种。E-mail：857946447@qq.com。