神经电调控 双模信号检测系统与活体大鼠脑深部核团实验验证

    张禹　徐声伟　何恩慧　肖桂花　宋轶琳　高飞　王蜜霞　蔡新霞

    

    

    

    摘?要?深脑核团电刺激（DBS）已成为改善帕金森病人运动障碍的有效治疗手段，然而其确切的治疗机制仍然不明。目前， DBS机制探究系统多由电刺激仪器和信号检测仪器两部分构成，多台实验设备的长期开启易产生操作程序复杂、环境噪声增多和资源浪费等问题。本研究建立了一套综合性实验系统，包括将电刺激功能与神经双模信号检测功能集成的神经电调控?雙模信号检测仪器和基于微机电加工技术制备的微电极阵列（MEA）。在体实验前，对经纳米铂黑和Nafion膜修饰的MEA进行体外标定。实验结果表明，1～50 μmol/L多巴胺（DA）溶液与修饰后的电极表面氧化电流值呈良好的线性关系，线性相关系数为0.998。随后，设计并进行了以前脑内侧束为电刺激靶点，纹状体为神经信息检测核团的活体大鼠实验。实验结果表明，纹状体内DA浓度在刺激后迅速上升，最高达2.06 μmol/L， 约为刺激前水平的1.57倍;神经元动作电位发放率增加，由刺激前的1.17 Hz上升至6.77 Hz;场电位活动增强，功率由刺激前的0.19 mW上升至0.64 mW。本研究设计并制备的神经电调控?双模信号检测系统实现了电刺激与双模信号检测的功能集成，有望为DBS治疗机制的探究提供有效实验工具。

    关键词?深脑核团电刺激; 微电极阵列; 多巴胺; 神经电生理信号; 神经递质

    1?引 言

    帕金森疾病是一种影响全世界数百万人的神经退行性疾病，主要的病理变化为纹状体内多巴胺（DA）浓度的明显减少和黑质致密部多巴胺能神经元的变性缺失[1～3]，导致患者出现运动迟缓、肌肉僵直和静止性震颤等运动症状，以及嗅觉障碍、睡眠障碍和抑郁等非运动症状[4，5]。20世纪90年代以来，深脑核团电刺激（DBS）被认为是减轻帕金森疾病中药物难治性运动症状的有效治疗手段[6～8]，通过对脑内特定神经核团施加一定参数的电脉冲，达到减轻病态症状的效果。为探究DBS的治疗机制，研究者多采用包括电刺激器和单模信号检测仪器在内的两套独立仪器[9，10]，多台实验设备的长期开启易造成操作步骤繁琐、环境噪声增多和资源浪费等问题，不利于脑内微弱信号的测量。

    前脑内侧束（MFB）作为黑质?纹状体通路中重要的神经核团，被认为是基底节回路中有效的电刺激靶点之一[11]。研究者通过碳纤维电极探测的方法发现，经MFB?DBS后，纹状体内DA浓度有所升高[12]，但由于缺少对神经电生理信号的同步记录，纹状体内神经元在刺激前后神经信息的综合性变化未得到直观描述。

    为解决上述问题，在前期工作的基础上[13，14]，本研究设计并建立了一套综合性实验系统，包括将电刺激功能和神经双模信号检测功能集成的神经电调控?双模信号检测仪器和经纳米材料修饰的微电极阵列（MEA）生物传感器。基于此系统开展活体动物实验，通过向大鼠MFB施加电刺激，同步观察纹状体内DA的浓度变化和神经元的放电情况。

    2?实验部分

    2.1?神经电调控?双模信号检测仪器

    本研究基于 LabVIEW 虚拟仪器开发平台，在实验室原有的双模信号检测系统[15，16]的工作基础上，设计并制备了集成电刺激功能和神经双模信号检测功能于一体的神经电调控?双模信号检测仪器（图1）。

    2.1.1?仪器电源部分?此仪器采用15 V统一单向供电。电刺激部分利用高压直流电源变换为低压直流电源模块（DCDC）和低压差线性稳压器（LDO）将15 V单向电源转换为±12 V双向供电。电生理检测部分和电化学检测部分利用DCDC和LDO将15 V单向供电值转换为±5 V双向供电。

    2.1.2?电刺激部分?本系统设计的电刺激模块提供矩形波、正弦波、三角波和用户自定义方波等基本刺激图形，供用户选择，用户可通过上位机软件对所选波形进行参数编辑（脉冲幅值、脉冲宽度、正负脉冲间隔和脉冲数量），确定后的刺激波形由采集卡的模拟信号输出口输出。当用户选择电压信号刺激时，采集卡的输出将经过一个电压跟随器输出至刺激电极; 当用户选择电流信号刺激时，采集卡输出的电压将经过一个电压?电流转换电路再输出至刺激靶点。数据采集卡采用美国 NI 公司的USB6255 OEM，具有2个模拟信号输出口。

    2.1.3?神经信息检测部分?神经信息检测部分包括4通道的神经电化学信号检测模块和64通道的神经电生理信号检测模块。神经电化学信号检测方面，以包括工作电极、对电极和参比电极在内的三电极体系作为设计基础。利用采集卡的模拟信号输出功能，实现工作电极上氧化/还原电位的施加; 利用电流?电压转换放大电路和采集卡模拟信号采集功能，将神经递质反应所引起的电流变化转换为电压信号，并放大至mV级被采集卡采回。神经电生理信号检测方面，由于神经电生理信号为μV级的微弱信号，过长的传输距离易使信号发生畸变、失真。因此，在信号进入主放大滤波电路前，首先在传感器的末端接入放大倍数为10的前置放大器，进行信号的第一次放大，随后利用漆包线将信号传至主放大滤波电路，再进行100倍的第二次放大，最终不易受环境影响的mV级电压信号被采集卡的模拟信号采集端口采回。

    2.2?其它仪器与试剂

    KH2200E 超声振荡器（中国合创公司）; ?BX51TRF光学显微镜（日本Olympus 公司）; S?800 扫描电镜（日本 Hitachi 公司）; 脑立体定位仪（美国Stoelting公司）; 50?12?1C液压探针驱动器（美国FHC公司）; MW?D20 实验室超纯水器（中国美诚公司）; 双极型同心圆电刺激电极（美国Microprobes公司）; 128 通道模拟神经信号发生器（Blackrock 公司）。

    0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS， Na2HPO4NaH2PO4KCl， pH 7.4，美国Sigma公司）; 多巴胺（DA）、二羟基苯乙酸（DOPAC），谷氨酸（Glu）和抗坏血酸（AA）（美国Alfa Aesar公司）; 氯铂酸（H2PtCl6）和醋酸铅（Pb （CH3COO）2）（中国国药化学试剂）; 生理盐水（中国双鹤制药公司）; Nafion阳离子交换膜（美国Sigma公司）。实验用水为去离子水。整个实验过程在室温下进行。

    2.3?微电极阵列的制备

    所使用的16通道微电极阵列[15]是基于微机电加工工艺技术，以硅片为基底，以铂（厚度250 nm）为导电层，以氧化硅（厚度300 nm）和氮化硅（厚度500 nm）为双绝缘层进行制备。在体实验前，为降低电极位点的阻抗值，将纳米材料修饰在电极表面。 2 mmol/L H2PtCl6和2 mmol/L Pb（CH3COO）2按体积比1∶1混合后作为电镀液，MEA为工作电极，Pt为对电极，采用两电极体系的计时电流法（?1 V，50 s）电镀纳米铂黑。其中，Pb2+的加入更有利于生成大量的、小尺寸铂黑纳米粒子[16～18]。为提高MEA对DA的选择性，将Nafion膜涂覆在位点表面，并通过100℃的红外探照灯加热30 min将其烘干。

    2.4?实验方法

    2.4.1?神经电调控?双模信号检测仪器的性能测试?为验证神经电调控?双模信号检测仪器的功能可行性，利用电刺激模块向外施加双向矩形波电刺激（100 Hz，200 μA，1 s）; 通过信号发生器的输出模拟神经电生理信号; 通过在100 MΩ金属膜电阻两端施加+0.5 V电位模拟神经递质的反应电流，以此观察仪器的电刺激输出情况和双模信号检测情况。对于采集卡采回的结果，一方面，将刺激输出的实际电压值与上位机软件设置的电压值进行比较，证明电刺激输出的准确性; 另一方面，通过观察电刺激施加前后神经信号检测模块检测到的信号幅值变化，探究电刺激模块与检测模块的串扰情况。

    2.4.2?微电极阵列的基本性能测试

    在体实验前，使用以MEA为工作电极、Ag|AgCl为参比电极，Pt为对电极所构成的三电极体系探究DA浓度与电极表面氧化电流之间的关系。具体地，氧化电压值设置为+0.5 V，1～50 μmol/L DA溶液依次滴加至PBS中，观察电极表面氧化电流值的变化。

    为探究MEA的抗干扰性能，参考纹状体内各个神经递质的浓度[19～22]，100 μmol/L UA、30 μmol/L DOPAC、1 μmol/L Glu和300 μmol/L AA被依次滴加至PBS中，观察电极位点的氧化电流值变化。

    2.4.3?电刺激下的双模检测实验?为验证系统的可行性及探究电刺激下纹状体内神经元的活动变化，本研究基于神经电调控?双模信号检测系统，设计了以MFB为刺激靶点，以纹状体为检测靶点的DBS实验。选取200～300 g健康雄性大鼠，经20%乌来糖（0.7 ml/100 g）麻醉后进行开颅手术。电推进器以每隔5 min下降500 μm的速度将电刺激电极植入至前脑内侧束（AP： 1.92 mm， ML： 2.2 mm，DV：8.4 mm）， 到达目标区域后，利用牙科水泥将其固定; 将微电极阵列以10 μm/s的速度植入至纹状体（AP： 1.08 mm， ML： 2.8 mm，DV： 4～5 mm），其中8个通道作为神经电生理信号检测通道，1个通道作为神经递质DA的检测通道。Ag|AgCl参比电极和颅骨钉的位置分别为AP： 1.92 mm， ML： 2.2 mm和AP： 6.72 mm， ML： 2.8 mm。植入电极后，待大鼠状态稳定，将多巴胺氧化电压值设置为+0.5 V，进行电刺激下的纹状体内神经信息记录。其中，电刺激参数设置为双向方波，刺激频率100 Hz， 刺激幅值200 μA， 刺激脉冲数100 plus，持续时间为1 s。

    3?结果与讨论

    3.1?神经电调控?双模信号检测系统的性能测试在电刺激方面，对比上位机设置的電流值，仪器输出的电流值准确度>96%。在电生理信号采集方面，电压信号能够被成功地采回至采集卡，并且进行显示与保存; 当电刺激输出时，刺激前后信号基线无明显变化（图2A）; 在电化学信号采集方面，准确的电流值被采集卡实时采回，在上位机显示; 刺激前后电化学信号电流基线无明显变化（图2B）。此实验验证了电刺激模块、电生理信号检测模块和电化学信号检测模块都能够很好地工作，并且相互之间没有产生明显干扰。

    3.2?微电极阵列的基本性能

    与裸电极相比（图3A），修饰后的位点集聚了大量的纳米铂黑颗粒（图3B），极大地增加了电极与神经元的接触面积。电极体外标定结果表明，1～50 μmol/L DA溶液与电极表面氧化电流值呈良好的线性关系，线性相关系数为0.998，对应斜率为12.254 pA/μmol/L（图4A和图4B）。干扰物测试结果表明，修饰后的电极对UA、DOPAC和Glu几乎无响应，对AA的响应为9 pA（图4C）。因此，干扰物对DA测量的影响很小。

    3.3?电调控下纹状体内神经信号检测结果

    活体动物实验结果如图5所示。MFB?DBS后，DA浓度迅速升高，最高达2.06 μmol/L，约为刺激前水平的1.57倍。与此同时，神经元发放活动和场电位波动情况明显增多。经过主成分分析和聚类分析得到的动作电位波形如图6A所示，峰值范围为128.44～807.34 μV， 且具有较长的复极化时间（2.1 ms）。神经元的发放率由稳定状态的1.17 Hz上升至6.77 Hz， 相比于未刺激之前增加约5.7倍（图6B）。相似地，代表细胞群体特征的场电位信号，

    在受到刺激后，高频活动得到明显提升（图6C），场电位活动功率由刺激前的0.19 mW上升至0.64 mW（图6D）。

    4?结 论

    设计并建立了一套神经电调控?双模信号检测系统，实现了电刺激施加、神经电化学信号检测和神经电生理信号检测的功能集成。实验结果表明，仪器内部的刺激模块与检测模块能够有效地工作，相互之间未造成明显的信号干扰。基于此系统开展的体外标定实验表明，修饰后的微电极阵列对于1～50 μmol/L浓度范围内的多巴胺溶液具有良好的氧化电流响应; 对于UA、DOPAC、Glu、AA等常见干扰物的响应极低。通过设计MFB?DBS大鼠实验，不仅验证了整个系统可良好地应用于活体动物实验，而且说明了MFB?DBS具有提高纹状体内多巴胺浓度和促进神经元兴奋性发放的作用。

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    Neural Electrostimulation?Detection System and

    Experimental Validation of Deep Brain Nuclei in Vivo

    ZHANG Yu1，2， ?XU Sheng?Wei1，2， ?HE En?Hui1，2， ?XIAO Gui?Hua1，2，

    SONG Yi?Lin1，2， ?GAO Fei1，2， ?WANG Mi?Xia1，2， ?CAI Xin?Xia1，2

    1（State Key Laboratory of Transducer Technology， ?Institute of Electronics，

    Chinese Academy of Sciences， ?Beijing 100190， ?China）

    2（University of Chinese Academy of Sciences， ?Beijing 100049， ?China）

    Abstract?Although deep brain stimulation （DBS） has become an effective treatment for improving dyskinesia in Parkinson's disease， ?the exact treatment mechanism remains unclear. In addition， ?the current system researching DBS mechanism is always composed of two individual parts： the electrical stimulation instrument and the signal detection instrument， ?which makes it easy to cause the complicated operation of procedure and the waste of resource. In this work， ?a comprehensive experimental system was established， ?including an electrostimulation?detection instrument which integrated the function of electrical stimulation and neural signal detection， ?and the microelectrode arrays （MEA） which were fabricated by micro?electro?mechanical system （MEMS） and modified by nanoplatinum and nafion membrane. Experimental results showed that dopamine in concentration range of 1-50 μmol/L had a good linear relationship with the surface oxidation current of the modified MEA， ?and the linear correlation coefficient was 0.998. What's more， ?DBS was designed with the medial forebrain bundle （MFB） as stimulation target and the striatum as detection area， ?which made the striatal simultaneous observation of dopamine concentration and neuronal firing was achieved while electrical stimulation was applied. Experimental results indicated that the concentration of dopamine in the striatum increased rapidly after stimulation， ?reaching a maximum of 2.06 μmol/L which was about 1.57 times of the pre?stimulation level; the spike firing rate increased from 1.17 Hz to 6.77 Hz; and the power of local field potential was enhanced from 0.19 mW to 0.64 mW. The electrostimulation?detection system developed in this study realized the integration of electrical stimulation and dual?mode signal detection， ?which simplified the complex experimental steps and was expected to provide an effective experimental tool for the exploration of DBS treatment mechanism.

    Keywords?Deep brain stimulation; Microelectrode arrays; Dopamine; Neuro?electrophysiological signal; Neurotransmitters