基于碳点的适配体荧光传感器检测农药乐果

    陆婷婷　王金龙　詹相强　吴远根

    

    

    

    摘 要 构建了一种基于核酸适配体调控碳点荧光强度的农药乐果适配体荧光传感器。在乐果存在下，适配体SS24-S-35可改变纳米银（AgNPs）对柠檬酸-乙二胺碳点荧光的猝灭作用，且碳点的荧光猝灭程度与乐果浓度成正比，由此建立了一种乐果的适配体荧光检测方法。对荧光猝灭机制进行了探讨，对碳点种类、AgNPs浓度等影响因素进行了考察。在最优条件下，检测乐果的线性范围为6～200 μg/L （R2=0.984），检出限为2.24 μg/L （3σ/S）。此传感器特异性良好，其它农药对乐果的检测无明显干扰。将此适配体荧光传感器应用于实际农产品中乐果农药检测，回收率为85.1%～105.0%，表明在农药残留检测中具有潜在应用价值。

    关键词 农药检测; 适配体; 纳米银; 碳点; 荧光共振能量转移

    1 引 言

    乐果（Dimethoate） 是应用较为广泛的有机磷农药之一，其快速杀虫杀螨效果良好，多应用于果蔬、棉花等作物。 在提高农作物产量的同时，乐果本身及其残留也会对环境造成污染，威胁人类的健康。乐果可通过皮肤接触等途径进入人体，造成急性或慢性中毒，严重时可致人死亡[1]。因此，研究高效灵敏的乐果农药残留检测方法具有重要意义。传统的乐果检测方法，如气相色谱[2]、液相色谱-质谱联用[3]等方法虽灵敏度高、结果可靠，但多需借助大型仪器和专业技术人员，而且预处理过程繁琐，不适用于现场快速检测。而比色法[4]、红外光谱法[5]等乐果快速检测方法相对简单方便，但检测结果易受环境因素影响。

    与传统方法和比色法等相比，荧光检测法具有背景信号低、灵敏度高、操作简单等特点[6]，近年来受到研究者的关注。传统荧光检测方法一般采用对某些物质具有特异性识别的荧光染料分子[7]或量子点材料[8]作为荧光元件。荧光染料分子多为有机分子，光稳定性较差且合成较难。量子点是一类具有良好光稳定性的金属半导体纳米晶体，但多数量子点含有重金属，其生物毒性限制了其应用与发展[7，8]。研究者致力于开发具有更稳定光学特性及低毒的物质作为荧光探针。荧光碳量子点又称碳点（Carbon dots） [9]，具有独特的发光性能、良好的生物相容性、化学稳定性、低毒性、易合成等特点，近年来广泛用于生物成像、免疫分析、小分子检测与分析等研究中[10]。利用碳點建立的荧光传感器具有快速灵敏等优点，但仍易受其它物质的干扰[11]。

    为了克服这些问题，研究者将具有高特异性识别的核酸适配体（Aptamer）引入荧光检测方法中，使其具有更高的灵敏度和更好的特异性。核酸适配体是一类能特异性识别靶物质的功能性单链DNA或者RNA[12]，具有化学稳定性好且易修饰等优点，可作为识别元件应用于多个检测领域[13，14]。最近，本研究组利用核酸适配体对靶物质良好的识别性能，并结合碳点优异的荧光特性，构建了高效快速检测食品中啶虫脒农药残留的适配体荧光传感器[15]。然而，目前还未有利用适配体碳点荧光传感器检测乐果农药的报道。分散状态的纳米银（Silver nanoparticles， AgNPs）具有良好的消光能力[16]，可通过荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer， FRET）效应显著猝灭柠檬酸-乙二胺碳点的荧光信号。本研究以核酸适配体SS24-S-35序列为乐果农药的识别分子，结合荧光碳点， 通过乐果农药与适配体的相互作用，调控AgNPs对碳点荧光的猝灭性能，在此基础上，构建可特异性检测乐果的适配体荧光传感器，并对其检测性能和实际应用性能进行了评价。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    F-4600型荧光分光光度计、透射电子显微镜（日本Hitachi公司）; UV-2700型紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）; 振荡型恒温金属浴（上海一恒科技有限公司）。

    有机磷农药核酸适配体（SS24-S-35）[17]序列为： 5'-AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAG AGCT-3'，由上海生工生物工程股份有限公司合成与纯化; AgNO3、NaBH4、柠檬酸钠、柠檬酸、乙二胺（EDA）、 H3PO4、 碳二亚胺（EDC）、甲酰胺、乐果、丙溴磷等购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 其它试剂均为市售分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

    2.2 碳点的制备

    根据文献报道，采用水热合成法制备了3种荧光碳点。

    柠檬酸-乙二胺碳点（CD-1）的制备[15]： 将1.26 g柠檬酸和1608 μl EDA加入30 mL双蒸水中，转移至水热反应釜中，180℃反应5 h。所得产物用截留分子量为300 Da的透析袋透析纯化， 4℃下保存。

    柠檬酸-磷酸碳点（CD-2）的制备[18]： 称取1.5 g柠檬酸溶于10 mL水中，加入10 mL H3PO4、1 mL EDA、0.01 mg EDC，混合均匀后转移至水热反应釜中，于250℃反应2 h。所得产物于11200 r/min下离心10 min，沉淀溶于乙醇中，再重复离心3次，所得产物经0.22 μm微孔滤膜过滤后分散于水中，于4℃保存。

    柠檬酸-甲酰胺碳点（CD-3）的制备： 将0.6 g柠檬酸和2 mL甲酰胺加入18 mL水中，转移至反应釜中，于190℃反应3 h。所得产物用截留分子量为300 Da的透析袋透析纯化， 4℃下保存。

    2.3 纳米银制备[19]

    将5 mL AgNO3 （10 mmol/L）和5 mL柠檬酸钠（10 mmol/L）加入89 mL水中反应20 min，在磁力搅拌条件下快速加入8.8 mg NaBH4，继续搅拌反应2 h，得到稳定的黄色AgNPs溶胶溶液。于4℃保存。

    2.4 乐果的检测

    首先将SS24-S-35序列 （3 μmol/L）置于振荡型恒温金属浴中，在95℃、800 r/min条件下变性5 min。取5 μL SS24-S-35序列与5 μL不同浓度的乐果混合均匀，于30℃孵育10 min。 加入150 μL AgNPs （1.27 nmol/L），继续于30℃条件下反应10 min。最后加入5 μL CD-1 （0.5 mg/mL）、25 μL NaCl （300 mmol/L），再加水定容至500 μL， 30℃下反应30 min。使用1 cm石英荧光比色皿，设置激发和发射狭缝宽均为10 nm，激发波长为360 nm，发射波长为440 nm，测定样品的荧光光谱。再以水代替乐果作为空白对照，并测定其荧光强度（F0）。计算空白体系（F0）与样品检测体系（F）在440 nm处的荧光强度差值（F0-F）。

    2.5 实际样品分析方法

    小麦、苹果、辣椒、西红柿等农产品均为市售商品，按文献[20＼]的方法进行预处理。取不同浓度的乐果标准品均匀喷涂在彻底清洗干净的样品表面，自然风干。取20 g样品加入100 mL 20%甲醇中，静置萃取30 min，然后用0.22 μm滤膜过滤，得到最终样品处理液。将所得样品处理液加入检测体系中，采用本方法进行检测。

    3 结果与讨论

    3.1 碳点的表征

    本研究制备了3种碳点，并进行了表征。以CD-1为例，由透射电镜图（图1A）可知，CD-1为均匀球形结构，具有良好的分散性，平均粒径约为10 nm （图1B），與文献[15＼]一致。CD-1的紫外-可见（UV）吸收光谱和荧光（FL）光谱如图1C所示。在日光灯照射下，碳点的水溶液呈淡黄色，而在紫外灯的照射下发出强烈的蓝色荧光。碳点CD-1在340 nm处有强烈的紫外吸收峰，这可能与n-π*（CO）跃迁有关[15，21]。此碳点的最大激发波长和发射波长分别为360和440 nm，Stokes位移较大（80 nm），表明此碳点能发射强烈而稳定的荧光[22]。由图1D可知，CD-1的最大发射波长不随激发波长的移动而发生变化，说明此碳点的荧光发射波长无激发光依赖性，其发光机理是基于表面缺陷， 而不是基于尺寸依赖的带隙跃迁[21]。根据本研究组之前的研究结果[15]，CD-1表面带有NH2、OH、COOH，这赋予了CD-1良好的荧光性能和亲水性能[21，23]。

    3.2 实验原理与验证

    AgNPs溶胶体系猝灭碳点荧光性能与其分散形态有关，不同粒径AgNPs的最大紫外吸收波长不同[16]。由图1C可知，制备的AgNPs溶胶在320～500 nm范围内有很强的吸收，最大吸收峰位于390 nm处，与CD-1的荧光发射光谱部分重叠。CD-1表面含有大量的NH2， 能与AgNPs表面的COOH产生静电作用，从而拉近二者的距离[24]。因此，AgNPs可能通过FRET作用猝灭CD-1的荧光信号[25]。AgNPs表面覆盖有柠檬酸，其颗粒之间可通过负电荷羧基的静电排斥作用，保持AgNPs溶胶的稳定存在[19]。如果向溶胶体系中加入高浓度NaCl，可通过静电屏蔽作用破坏AgNPs的稳定性，使其产生凝聚 [26]，导致AgNPs在390 nm处吸收峰降低，甚至消失，而聚集的AgNPs无法猝灭CD-1荧光信号。

    本研究通过核酸适配体调控AgNPs在高浓度盐溶液中的分散形态，实现碳点荧光信号的可控猝灭，在此基础上建立用于乐果检测的适配体荧光传感器，检测原理如图2A所示。适配体SS24-S-35序列由于与AgNPs相互作用较弱[27]，因而在高浓度NaCl条件下，AgNPs会产生聚集现象，无法再猝灭后续加入的碳点荧光，此时体系在440 nm处展现蓝色荧光。当向检测体系中加入乐果时，适配体SS24-S-35序列能特异性结合乐果农药[28]，而乐果分子中OCN键的O和N可提供孤电子对，与AgNPs表面的Ag原子形成配位键[29]，从而进一步增强AgNPs表面的电负性，使其在高浓度NaCl体系中可稳定存在。此时，分散状态的AgNPs可通过FRET猝灭碳点荧光信号。

    通过测定碳点溶液加入乐果、适配体、NaCl前后的荧光光谱，进一步考察适配体荧光传感器检测乐果的可行性。由图2B可知，纯CD-1溶液发出明亮的蓝色荧光，在440 nm处有强的荧光发射峰。当加入AgNPs时，CD-1荧光信号被显著猝灭（图2B-b），说明AgNPs能有效猝灭碳点荧光。当AgNPs先后与适配体和NaCl孵育一定时间，再加入碳点，此时碳点溶液仍然发出很强的蓝色荧光（图2B-c）。这可能是核酸适配体与AgNPs之间的相互作用力较弱[27]，加入高浓度NaCl后，导致AgNPs聚集，而聚集的AgNPs无法再猝灭碳点荧光。当AgNPs先后与乐果和NaCl孵育一定时间，此时碳点溶液依然发出很强的蓝色荧光（图2B-d）。推测其原因可能是乐果不会改变AgNPs表面的电负性，说明乐果本身不会干扰NaCl对AgNPs的聚集及其对碳点的作用。当向检测体系加入乐果后，碳点荧光被逐渐猝灭（图2B-e～g），且其猝灭程度与乐果农药的浓度呈现正相关。上述结果说明，乐果可与适配体和AgNPs形成复合物，使AgNPs表面的负电荷增加[27]，因而后续加入高浓度NaCl后，AgNPs仍会保持分散状态，可有效猝灭传感体系中碳点的荧光。

    3.3 实验参数的优化

    3.3.1 不同碳点体系对乐果检测的影响 碳点作为适配体荧光传感器的荧光信号元件，其荧光特性与其尺寸和表面性质有关[21]。为了考察不同荧光碳点材料对乐果检测的影响，本实验制备了3种碳点荧光材料，进一步评价其在加入AgNPs和适配体前后的荧光信号，结果如图3A所示。所制备的3种碳点表面都掺杂了丰富的N元素，可赋予其良好的荧光性能[15，18，30]。加入AgNPs后，CD-1和CD-3的荧光被显著猝灭，荧光猝灭率分别达到68%和70%，而CD-2的荧光猝灭效果不明显。这是因为CD-1的最大激发波长为360 nm[15]，与分散状态AgNPs的最大吸收峰（390 nm）[19]波长相差较小，两者之间的FRET效应较强，所以CD-1的荧光被显著猝灭。而CD-2的最大荧光激发波长（340 nm）[18]与分散状态AgNPs的最大紫外吸收波长相距较远，二者之间无法发生有效的FRET效应，因此AgNPs对CD-2的荧光猝灭效果不明显。导致CD-3的荧光被猝灭的原因可能是AgNPs表面的Ag+与CD-3发生不可逆的静态猝灭作用[21，31]。当AgNPs与适配体作用后，在高浓度NaCl存在条件下，只有CD-1的荧光明显增强。当向传感溶液中加入农药乐果，此时CD-1的荧光又被显著猝灭，而CD-2和CD-3的荧光无明显变化，表明CD-2和CD-3无法构建适配体荧光传感体系。因此，本实验选用CD-1作为检测乐果的适配体荧光传感器的信号元件。

    3.3.2 AgNPs浓度对乐果检测的影响 考察了AgNPs浓度对乐果检测的影响，结果如图3B所示。随AgNPs浓度增加，传感体系的荧光信号变化逐渐增大。当AgNPs浓度为0.38 nmol/L时，体系的荧光淬灭（F0-F）达到最大。当AgNPs浓度过高时， NaCl只能诱导部分AgNPs聚集，导致空白实验组的碳点荧光信号过低。因此，后续实验选取荧光猝灭剂AgNPs浓度为0.38 nmol/L。

    3.3.3 NaCl浓度对乐果检测的影响 本传感体系中，NaCl通过调控AgNPs的分散状态影响碳点的荧光强度。考察了NaCl浓度对乐果检测的影响，结果如图3C所示。适配体荧光传感器的（F0-F）值随NaCl浓度的增加而增大，在15 mmol/L时达到最大值。因此，本研究选取NaCl浓度为15 mmol/L。

    3.3.4 核酸适配体浓度对乐果检测的影响 适配体SS24-S-35序列可调控AgNPs表面的电荷密度，从而影响其在高浓度NaCl中的分散状态。考察了适配体浓度对乐果检测的影响，结果见图3D。传感体系的（F0-F）值与适配体浓度成正相关，适配体浓度大于30 nmol/L时，（F0-F）值趋于稳定。因此，选择本传感体系中适配体的最佳浓度为30 nmol/L。

    3.4 方法的分析性能

    在优化的条件下，向适配体荧光传感器中加入不同濃度的乐果（6～650 μg/L），测定其荧光光谱。从图4A可知，随着乐果浓度的增加，传感体系的荧光逐渐被猝灭。当乐果浓度大于40 μg/L时，其与空白实验组的荧光强度有显著差异，因而本方法裸眼检测的最低浓度为40 μg/L。图4B的荧光光谱显示，随乐果浓度增加，传感体系中的荧光强度逐渐降低。由图4C可知，传感体系的（F0-F）值随着乐果浓度的增加而不断增大。传感体系（F0-F）值与乐果浓度在6～200 μg/L范围内呈线性关系，线性方程为Y= 2.027X + 0.558 （R2=0.984），检出限为2.24 μg/L（3σ/S）[32～34]，此值远低于中国农业部制定的农产品中乐果残留最大限量标准（50 μg/L） [35]。将此方法与现有的乐果农药快速检测方法进行了对比（表1）。电化学法有较高的检测灵敏度，但其需要修饰电极以及专业的操作仪器; 比色检测法大多用生物酶作为传感元件，对周围环境较敏感， 容易导致检测结果不准确。而现有的荧光检测方法多利用重金属量子点作为传感元件，易造成二次环境污染。本传感体系采用环境友好且易制备的荧光碳点作为传感元件，利用特异性高的适配体作为农药识别分子，所建立的检测方法具有快速、灵敏、绿色环保、低成本等优点。

    考察了本方法检测乐果的特异性。如图5所示，向荧光检测体系中加入相同浓度（200 μg/L）的不同种类农药，只有乐果农药样品组的荧光被显著猝灭。当向传感体系中同时加入乐果和其它农药时，其对应传感体系的（F0-F）值和同浓度的乐果样品组无明显差异，说明其它农药的存在对传感体系检测乐果无明显干扰。值得注意的是，氧化乐果的化学结构与乐果农药相似，且适配体SS24-S-35序列也能识别氧化乐果[17]，但传感体系加入氧化乐果后的荧光强度并没有发生较为明显的变化。推测其原因是氧化乐果分子在AgNPs表面的吸附过程缓慢，且会受到传感体系中Cl空间位阻的影响，导致其很难吸附到AgNPs表面[44＼] 。所以当向传感体系中加入氧化乐果时，传感体系的荧光无法被猝灭。

    3.5 实际样品分析

    取本地市售的小麦、苹果、辣椒、西红柿样品，按2.5节的方法处理，用建立的适配体荧光传感体系进行检测，结果见表2。乐果的加标回收率在85.1%～105.0%之间，相对标准偏差（RSD）在1.1%～90%之间，表明此传感方法可应用于实际农产品中的乐果农药检测。

    4 结 论

    利用AgNPs与柠檬酸-乙二胺碳点之间的FRET效应，结合核酸适配体特异性识别乐果的特性，建立了一种适用于乐果农药检测的适配体荧光传感器。此适配体荧光传感器对乐果具有高选择性，可实现对乐果农药的高灵敏度定量检测和可视化定性检测， 对乐果的检出限为2.24 μg/L，裸眼检出限为40 μg/L。将此适配体荧光传感器用于实际样品中乐果的检测，加标回收率为85.1%～105.0%。与传统的荧光适配体传感器相比，此传感器成本低、制作简单、灵敏度高，对食品中乐果农药的检测具有潜在的应用价值。

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    Abstract A fluorescent aptasensor for detection of dimethoate pesticide based on aptamer regulated carbon dots was fabricated. In the presence of dimethoate， SS24-S-35 aptamer could alter the quenching efficiency of silver nanoparticles （AgNPs） on the fluorescence of carbon dots prepared from ethylenediamine and citric acid， and the degree of fluorescence quenching was proportional to the concentration of dimethoate molecules. Therefore， this strategy used the proposed aptasensor to quantitatively detect dimethoate pesticide by fluorescent assay. To improve the detection performance of the as-prepared aptasensor， the fluorescence quenching mechanism of AgNPs on carbon dots was fully discussed， and some parameters such as the types of carbon dots and the amount of AgNPs were investigated. Under optimal conditions， the aptasensor could detect dimethoate in a linear range from 6 μg/L to 200 μg/L （R2=0.984）， with a limit of detection （LOD） as low as 2.24 μg/L （3σ/S）. Moreover， the further studies confirmed that other pesticides had negligible effect on detection of dimethoate， indicating the excellent specificity of aptasensor for dimethoate detection. The aptasensor was succesfully used in detection of dimethoate pesticide in real agriculture products with recovery of 85.1%-105.0%， which indicated that the proposed aptasensor had potential application in the detection of pesticide residues.

    Keywords Pesticides detection; Aptamer; Silver nanoparticles; Carbon dots; Fluorescence resonance energy transfer

    （Received 25 July 2019; accepted 15 November 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos.21565009， 31760486）， the Natural Science Foundation of Guizhou Province （No. [2016＼]1403）， the Science and Technology Support Program of Guizhou Province for Social Development （No. [2018＼]2795）， and the Foundation of Key Laboratory of Wuliangye-flavor Liquor Solid-state Fermentation （No. 2018JJ002）， China National Light Industry.