高产纤维素酶菌株的微波诱变及筛选研究

    王强强+莫海飞+董静+张利+伍红

    摘要：为了能够选育出一株高产纤维素酶的优良菌株，采用微波对其孢子悬液进行不同时间的辐照处理后，筛选出一株能高产纤维素酶的突变菌株B40 1，在最适产酶条件下，该突变菌株所产纤维素酶的滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力分别是出发菌株的169.9%、110.0%。

    关键字：里氏木霉；纤维素酶；微波诱变；酶活力

    中图分类号：S852.6文献标识码：A文章编号：1007-273x（2014）03-0005-03

    纤维素是地球上最丰富且最廉价的可再生资源之一，棉、木、麻及各种秸秆中均含有丰富的纤维素。目前已经得到的纤维素酶仍不能满足工业生产的需要，所以寻找新的适于再生能源需要的高催化活性、低成本的纤维素酶，依旧是此后的研究热点[1 3]。寻找和开发高产纤维素酶新菌种，选育出纤维素酶高产优良菌株是纤维素资源能否高效利用的关键问题，也是今后纤维素酶高产菌选育研究的一项重要任务，具有非常重要的生态效益、经济效益和社会意义[4 7]。

    微波是一种高频电磁波，能够对一些极性分子如水分子、蛋白质、核苷酸、碳水化合物等产生快速震动的刺激作用，使细胞内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受到损伤，引起DNA结构发生改变，从而发生遗传变异[8]。本试验以里氏木霉Rutc30为出发菌株，经微波辐照处理，最终选育出一株高产纤维素酶的里氏木霉突变菌株B40 1。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1菌种 里氏木霉菌株（TrichodermareeseiRutc30），由本实验室保存。

    1.1.2主要仪器 ODELGSKP 01BII型隔水式电热恒温培养箱（湖北省黄石市医疗器械厂）；HZQ CV型空气振荡培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器厂）；UV 6100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；家用微波炉（额定输出功率800 W，脉冲频率2450 MHz）；ST16R型台式高速冷冻离心机Thermo（德国）。

    1.1.3主要试剂 ①DNS试剂：3，5 二硝基水杨酸5.3 g，NaOH 9.9 g，酒石酸钾钠153 g，无水亚硫酸钠4.15 g，苯酚3.8 mL，蒸馏水708 mL；②葡萄糖标准溶液：称取葡萄糖0.036 g，蒸馏水定容至100 mL；③0.05 mol/mL，pH 4.8的檬酸 柠檬酸钠缓冲液：无水柠檬酸9.6 g，无水柠檬酸钠16.1186 g，蒸馏水定容至100 mL等。

    1.1.4培养基 ①土豆培养基：马铃薯20 g，葡萄糖2 g，琼脂2 g，自来水定容至100 mL，pH自然；②分离培养基：KH2PO4 0.100 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，（NH4）2SO4 1.000 g，CMC Na 1.000 g，去氧胆酸纳0.250 g，刚果红0.020 g，琼脂2.000 g，蒸馏水定容至100 mL，pH自然；③MM培养基：葡萄糖20 g，（NH4）2SO4 5.0 g，KH2PO415 g，MgSO4·7H2O20.6 g，CaCl2 0.453 1 g，CoCl2·6H20 3.7mg，FeSO4·7H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O1.4mg，MnSO4·H2O1.6mg，加蒸馏水至1 000 mL，pH自然。

    1.2方法

    1.2.1葡萄糖标准曲线 取6支10 mL试管，分别加入相应试剂，于沸水浴中显色5 min，取出后用冰水迅速冷却，加入蒸馏水至5 mL，摇匀静置，于540 nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线[9]。

    1.2.2菌株的活化、培养与孢子悬液制备 刮取冷冻里氏木霉菌丝少许，转至盛有0.85%生理盐水的试管内，40 ℃水浴振荡复苏100 s；吸取适量菌液平板涂布，30 ℃恒温培养4 d；用pH为7.0的磷酸缓冲液冲洗下孢子，180 r/min，30℃恒温振荡30 min，使孢子充分活化并分散；用血球计数板进行计数，最后用相同浓度的生理盐水将孢子悬液稀释至106个/mL[8 11]。

    1.2.3微波诱变 微波炉调至最大功率800 W，额定频率2 450 MHz。按不同的辐照时间对孢子悬浮液进行处理后，冰水浴1 min以消除微波热效应，取辐照后的孢子悬液涂布于分离培养基平板上，30 ℃恒温培养5d后进行菌落计数，同时计算微波不同辐照时间下的致死率[8，12]。致死率=（对照菌落数 处理菌落数）/对照菌落数×100%。

    1.2.4突变菌株的筛选及扩大培养 筛选培养5 d后，挑选透明圈与菌落直径之比大于2.0（H/C>2.0）、生长较快且产孢丰满的菌落，接种到MM培养基中，180 r/min，30 ℃恒温培养72 h。称取菌丝1 g（湿重）接种于产酶培养基中，相同条件下培养5 d。取适量培养液于4 ℃，6 000 r/min离心10 min，将上清液移至新的EP管中，备用[8，13 15]。

    1.2.5纤维素酶活力测定 ①取适量原菌株酶液，沸水浴中处理5 min，为对照组备用；②FPA活力测定：将新华滤纸裁成6 cm×1 cm的长方形，卷成圆筒状置于50 mL试管中，加入0.05 mol/mL、pH 4.8的柠檬酸 柠檬酸钠缓冲液1.5 mL，加酶液0.5 mL（空白先不加），50℃水浴平衡60 min后，加3 mLDNS试剂，沸水浴10 min后冰水中迅速冷却，补加蒸馏水至25 mL，摇匀静置，于540 nm处测吸光值。③羧甲基纤维素酶活力测定：在50 mL试管中先各加入1%CMC溶液0.5 mL，再加入0.5 mL酶液（空白先不加），50 ℃保温30 min后，加入2.0 mLDNS试剂，水浴煮沸5min，冰水迅速冷却后加蒸馏水至10 mL，混匀静置，在540 nm处测OD值[9，15]。

    纤维素酶活定义：在50℃条件下，每毫升样品每小时水解生成1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

    2结果与分析

    2.1葡萄糖标准曲线

    从图1可知，葡萄糖标准曲线y=0.002 3x 0.015，线性相关系数R2=0.997 8，线性较好，可以用于纤维素酶活力的测定。

    2.2微波对里氏木霉Rutc30的孢子悬液致死率

    以里氏木霉Ritc30为出发菌株，选用输出功率800W，额定频率2450MHz的微波对其孢子悬浮液进行辐照处理，辐照时间分别是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率与辐照时间关系见表1、图2。

    从表1、图2中可知，微波辐照处理里氏木霉孢子悬液20 s时，致死率达81.2%，当辐照时间为80 s时，致死率为95.8%，100 s处理时，致死率接近100%。说明里氏木霉Ritc30的孢子对微波极为敏感。

    从表1、图2中可知，微波辐照处理里氏木霉孢子悬液20s时，致死率达81.2%，当辐照时间为80 s时，致死率为95.8%，100 s处理时，致死率接近100%。说明里氏木霉Ritc30的孢子对微波极为敏感。

    2.2微波诱变后突变菌株的筛选及其产酶活力的鉴定

    微波诱变后，在分离培养基平板上挑选纤维素水解圈与菌落直径之比大于2.0（ H/C>2.0）、选择生长较快且孢子丰满的6株菌株，编号后对其摇瓶扩大培养，测定突变菌株产纤维素酶的酶活力，以鉴定突变菌株的产酶性能，结果见表2。

    从表2可知，挑选出的6株突变菌株，其所产纤维素酶的滤纸酶活力均高于原出发菌株，相对FPA活力为127.7%～169.9%。综合CMCase活力测定结果，最终选育出一株高产纤维素酶的菌株B40 1。其相对FPA活力、CMCase活力分别为169.9%、110.0%。

    3小结与讨论

    通过本试验，可知以微波作为菌株诱变方法是可行的，且具有较好的诱变效果；运用冰水浴法，对辐射后的孢子悬液冰水浴处理，极大程度上消除了微波热效应对试验的影响，从而使孢子悬液诱变过程中，温度始终保持在一个相对稳定的水平。由此建立了微波诱变方法。

    通过本试验的研究发现，当辐射时间为20 s时，致死率为81.2%，说明里氏木霉Rutc30对微波极为敏感，同时确定微波诱变的最佳时间为40s。筛选出的突变菌株B40 1，其所产纤维素酶的滤纸酶活力达到3.061 U，是原出发菌株所产纤维素酶活力的1.7倍。

    在试验过程中发现经微波诱变后的菌株生长较原菌株快很多，但菌丝高度较原菌株矮，其机理有待进一步的探讨。

    参考文献：

    [1]李燕红，赵辅昆.纤维素酶的研究进展[J].生命科学，2005，17（5）：392 397.

    [2]李 豪，车振明.微波诱变生物育种的研究[J].山西食品工业，2005（2）：5 14。

    [3]CHAND P，ARUNA A，MAQSOOD A M，et al.Novel mutation method forincrease cellulose production[J].The Society for Applied Microbiology，2004，98：318 323.

    [4]窦全林，陈 刚.纤维素酶的研究进展及应用前景[J].畜牧与饲料学，2006（5）：58 60.

    [5]LEER L，PAUl J，Weimer W，et al.Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66（3）：506 577.

    [6]张继泉，王瑞明，孙玉英，等.里氏木霉生产纤维素酶的研究进展[J].饲料工业，2003，24（1）：9 13.

    [7]贾红华，周 华，韦 萍.微波诱变育种研究及应用发展[J].工业微生物，2003，33（2）：46 50.

    [8]兰时乐，李立恒，王 晶，等.微波诱变结合化学诱变选育纤维素酶高产菌的研究[J].微生物学杂志2007，27（1）：20 25.

    [9]颜秋生，蒋传葵.纤维素酶制剂活力的测定方法[J].遗传，1979（3）：33 34.

    [10] 范志华，张陈云，刘金福，等.培养条件对里氏木霉产纤维素酶的影响[J].天津农学院学报，2005，12（2）：18 21.

    [11] 沈 萍，刘向东.微生物学[M].第2版.北京：高等教育出版社，2000.

    [12] 侯红萍，杜文娟.微波诱变筛选纤维素酶高产菌株[J].中国酿造，2008，（24）：44 46.

    [13] 董志扬，祝令香，于 巍.等.纤维素酶高产菌株的诱变选育及其产酶条件研究[J].核农学报，2001，15（1）：26 31.

    [14] 伍 红，秦天莺，谭德勇，等.瑞氏木霉QM9414利用蔗渣发酵产纤维素酶的研究[J].云南大学学报（自然科学版）.2008，30（6）：620 624.

    [15] 张瑞萍.纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定[J].印染助剂，2002，19（5）：52 53.

    纤维素酶活定义：在50℃条件下，每毫升样品每小时水解生成1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

    2结果与分析

    2.1葡萄糖标准曲线

    从图1可知，葡萄糖标准曲线y=0.002 3x 0.015，线性相关系数R2=0.997 8，线性较好，可以用于纤维素酶活力的测定。

    2.2微波对里氏木霉Rutc30的孢子悬液致死率

    以里氏木霉Ritc30为出发菌株，选用输出功率800W，额定频率2450MHz的微波对其孢子悬浮液进行辐照处理，辐照时间分别是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率与辐照时间关系见表1、图2。

    从表1、图2中可知，微波辐照处理里氏木霉孢子悬液20 s时，致死率达81.2%，当辐照时间为80 s时，致死率为95.8%，100 s处理时，致死率接近100%。说明里氏木霉Ritc30的孢子对微波极为敏感。

    从表1、图2中可知，微波辐照处理里氏木霉孢子悬液20s时，致死率达81.2%，当辐照时间为80 s时，致死率为95.8%，100 s处理时，致死率接近100%。说明里氏木霉Ritc30的孢子对微波极为敏感。

    2.2微波诱变后突变菌株的筛选及其产酶活力的鉴定

    微波诱变后，在分离培养基平板上挑选纤维素水解圈与菌落直径之比大于2.0（ H/C>2.0）、选择生长较快且孢子丰满的6株菌株，编号后对其摇瓶扩大培养，测定突变菌株产纤维素酶的酶活力，以鉴定突变菌株的产酶性能，结果见表2。

    从表2可知，挑选出的6株突变菌株，其所产纤维素酶的滤纸酶活力均高于原出发菌株，相对FPA活力为127.7%～169.9%。综合CMCase活力测定结果，最终选育出一株高产纤维素酶的菌株B40 1。其相对FPA活力、CMCase活力分别为169.9%、110.0%。

    3小结与讨论

    通过本试验，可知以微波作为菌株诱变方法是可行的，且具有较好的诱变效果；运用冰水浴法，对辐射后的孢子悬液冰水浴处理，极大程度上消除了微波热效应对试验的影响，从而使孢子悬液诱变过程中，温度始终保持在一个相对稳定的水平。由此建立了微波诱变方法。

    通过本试验的研究发现，当辐射时间为20 s时，致死率为81.2%，说明里氏木霉Rutc30对微波极为敏感，同时确定微波诱变的最佳时间为40s。筛选出的突变菌株B40 1，其所产纤维素酶的滤纸酶活力达到3.061 U，是原出发菌株所产纤维素酶活力的1.7倍。

    在试验过程中发现经微波诱变后的菌株生长较原菌株快很多，但菌丝高度较原菌株矮，其机理有待进一步的探讨。

    参考文献：

    [1]李燕红，赵辅昆.纤维素酶的研究进展[J].生命科学，2005，17（5）：392 397.

    [2]李 豪，车振明.微波诱变生物育种的研究[J].山西食品工业，2005（2）：5 14。

    [3]CHAND P，ARUNA A，MAQSOOD A M，et al.Novel mutation method forincrease cellulose production[J].The Society for Applied Microbiology，2004，98：318 323.

    [4]窦全林，陈 刚.纤维素酶的研究进展及应用前景[J].畜牧与饲料学，2006（5）：58 60.

    [5]LEER L，PAUl J，Weimer W，et al.Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66（3）：506 577.

    [6]张继泉，王瑞明，孙玉英，等.里氏木霉生产纤维素酶的研究进展[J].饲料工业，2003，24（1）：9 13.

    [7]贾红华，周 华，韦 萍.微波诱变育种研究及应用发展[J].工业微生物，2003，33（2）：46 50.

    [8]兰时乐，李立恒，王 晶，等.微波诱变结合化学诱变选育纤维素酶高产菌的研究[J].微生物学杂志2007，27（1）：20 25.

    [9]颜秋生，蒋传葵.纤维素酶制剂活力的测定方法[J].遗传，1979（3）：33 34.

    [10] 范志华，张陈云，刘金福，等.培养条件对里氏木霉产纤维素酶的影响[J].天津农学院学报，2005，12（2）：18 21.

    [11] 沈 萍，刘向东.微生物学[M].第2版.北京：高等教育出版社，2000.

    [12] 侯红萍，杜文娟.微波诱变筛选纤维素酶高产菌株[J].中国酿造，2008，（24）：44 46.

    [13] 董志扬，祝令香，于 巍.等.纤维素酶高产菌株的诱变选育及其产酶条件研究[J].核农学报，2001，15（1）：26 31.

    [14] 伍 红，秦天莺，谭德勇，等.瑞氏木霉QM9414利用蔗渣发酵产纤维素酶的研究[J].云南大学学报（自然科学版）.2008，30（6）：620 624.

    [15] 张瑞萍.纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定[J].印染助剂，2002，19（5）：52 53.

    纤维素酶活定义：在50℃条件下，每毫升样品每小时水解生成1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。

    2结果与分析

    2.1葡萄糖标准曲线

    从图1可知，葡萄糖标准曲线y=0.002 3x 0.015，线性相关系数R2=0.997 8，线性较好，可以用于纤维素酶活力的测定。

    2.2微波对里氏木霉Rutc30的孢子悬液致死率

    以里氏木霉Ritc30为出发菌株，选用输出功率800W，额定频率2450MHz的微波对其孢子悬浮液进行辐照处理，辐照时间分别是10、20、40、60、80、100 s后，孢子致死率与辐照时间关系见表1、图2。

    从表1、图2中可知，微波辐照处理里氏木霉孢子悬液20 s时，致死率达81.2%，当辐照时间为80 s时，致死率为95.8%，100 s处理时，致死率接近100%。说明里氏木霉Ritc30的孢子对微波极为敏感。

    从表1、图2中可知，微波辐照处理里氏木霉孢子悬液20s时，致死率达81.2%，当辐照时间为80 s时，致死率为95.8%，100 s处理时，致死率接近100%。说明里氏木霉Ritc30的孢子对微波极为敏感。

    2.2微波诱变后突变菌株的筛选及其产酶活力的鉴定

    微波诱变后，在分离培养基平板上挑选纤维素水解圈与菌落直径之比大于2.0（ H/C>2.0）、选择生长较快且孢子丰满的6株菌株，编号后对其摇瓶扩大培养，测定突变菌株产纤维素酶的酶活力，以鉴定突变菌株的产酶性能，结果见表2。

    从表2可知，挑选出的6株突变菌株，其所产纤维素酶的滤纸酶活力均高于原出发菌株，相对FPA活力为127.7%～169.9%。综合CMCase活力测定结果，最终选育出一株高产纤维素酶的菌株B40 1。其相对FPA活力、CMCase活力分别为169.9%、110.0%。

    3小结与讨论

    通过本试验，可知以微波作为菌株诱变方法是可行的，且具有较好的诱变效果；运用冰水浴法，对辐射后的孢子悬液冰水浴处理，极大程度上消除了微波热效应对试验的影响，从而使孢子悬液诱变过程中，温度始终保持在一个相对稳定的水平。由此建立了微波诱变方法。

    通过本试验的研究发现，当辐射时间为20 s时，致死率为81.2%，说明里氏木霉Rutc30对微波极为敏感，同时确定微波诱变的最佳时间为40s。筛选出的突变菌株B40 1，其所产纤维素酶的滤纸酶活力达到3.061 U，是原出发菌株所产纤维素酶活力的1.7倍。

    在试验过程中发现经微波诱变后的菌株生长较原菌株快很多，但菌丝高度较原菌株矮，其机理有待进一步的探讨。

    参考文献：

    [1]李燕红，赵辅昆.纤维素酶的研究进展[J].生命科学，2005，17（5）：392 397.

    [2]李 豪，车振明.微波诱变生物育种的研究[J].山西食品工业，2005（2）：5 14。

    [3]CHAND P，ARUNA A，MAQSOOD A M，et al.Novel mutation method forincrease cellulose production[J].The Society for Applied Microbiology，2004，98：318 323.

    [4]窦全林，陈 刚.纤维素酶的研究进展及应用前景[J].畜牧与饲料学，2006（5）：58 60.

    [5]LEER L，PAUl J，Weimer W，et al.Microbial cellulose utilization：Fundamentals and biotechnology[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66（3）：506 577.

    [6]张继泉，王瑞明，孙玉英，等.里氏木霉生产纤维素酶的研究进展[J].饲料工业，2003，24（1）：9 13.

    [7]贾红华，周 华，韦 萍.微波诱变育种研究及应用发展[J].工业微生物，2003，33（2）：46 50.

    [8]兰时乐，李立恒，王 晶，等.微波诱变结合化学诱变选育纤维素酶高产菌的研究[J].微生物学杂志2007，27（1）：20 25.

    [9]颜秋生，蒋传葵.纤维素酶制剂活力的测定方法[J].遗传，1979（3）：33 34.

    [10] 范志华，张陈云，刘金福，等.培养条件对里氏木霉产纤维素酶的影响[J].天津农学院学报，2005，12（2）：18 21.

    [11] 沈 萍，刘向东.微生物学[M].第2版.北京：高等教育出版社，2000.

    [12] 侯红萍，杜文娟.微波诱变筛选纤维素酶高产菌株[J].中国酿造，2008，（24）：44 46.

    [13] 董志扬，祝令香，于 巍.等.纤维素酶高产菌株的诱变选育及其产酶条件研究[J].核农学报，2001，15（1）：26 31.

    [14] 伍 红，秦天莺，谭德勇，等.瑞氏木霉QM9414利用蔗渣发酵产纤维素酶的研究[J].云南大学学报（自然科学版）.2008，30（6）：620 624.

    [15] 张瑞萍.纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定[J].印染助剂，2002，19（5）：52 53.