一例棘腹蛙“白内障”的病原分离鉴定
廖冰洁+樊汶樵+周莉+张毅+陈弟诗+孙志芳+吴宝红
摘要：在患“白内障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分离到一株圆形或椭圆形、葡萄状堆积的革兰氏阳性菌，经培养特性观察和致病性实验，确定候选菌株CQWU201401为“白内障”的病原；通过针对该菌株的生理生化特性鉴定和16S rDNA测序鉴定结果判定该候选菌株为金黄色葡萄球菌。采用药敏纸片法对该菌株进行药敏试验，在10种药物中的仅对四环素有耐药现象；针对该病原菌的分离鉴定和药敏试验为临床上防治该病提供了参考。
关键词：棘腹蛙；“白内障”；分离鉴定
中图分类号：S947.2 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0008-03
棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我国特有的珍稀两栖动物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肃等省[1]。棘腹蛙个体大，肉质鲜美，营养价值高，是名贵的营养滋补食品[2，3]。由于人为滥捕、水体污染、生态环境破坏等因素，野生棘腹蛙资源日趋匮乏，种群规模不断缩小，已被《中国濒危动物红皮书》列为易危物种[4]。近段时期，重庆地区部分棘腹蛙养殖场流行了一种致棘腹蛙眼睛表面出现白色薄膜，食欲废绝，甚至导致患蛙死亡的疾病，给生产上带来了极大的损失。为解决这一问题，本研究拟分离鉴定该病的病原，并针对性的进行抗生素筛选为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
取重庆地区某养殖场数只具“白内障”典型症状的棘腹蛙作为被检病料。患病棘腹蛙体重100～120g，体长40～50cm，剖检后可见眼球外附着一层白色薄膜，眼睛巩膜部有少量出血点，舌头表层和口腔内部有散在出血点，食道、胃和肠道出血。
健康棘腹蛙80只，购自重庆市某棘腹蛙养殖场，规格为每只100 g左右。
酵母提取物、胰蛋白胨等试剂购自OXOID公司；水解酪蛋白（M-H）琼脂/肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司；兔血在无菌条件下采自健康家兔；细菌微量生化管（批号：140123）和药敏试纸（批号：140227）购于杭州天和微生物试剂有限公司；DNA分子量标准、2×Taq PCR Master Mix等购自北京天根生化科技有限公司；其他常规试剂由实验室自行配制。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 无菌蒸馏水冲洗病蛙体表后，在超净操作台中接种病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分内脏器官等于LB固体和液体培养基，28 ℃培养24 h；同时做厌氧培养，观察细菌生长情况。对分离到的细菌进行纯化培养，并用5%兔血平板鉴定溶血性；挑取单个菌落革兰氏染色镜检，纯化后的候选菌株置-20 ℃保存。
1.2.2 致病性实验 用平板菌落计数法调整菌悬液浓度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供试棘腹蛙分为8组，每组10只，暂养一周无任何病变后方可用于实验；接种组以0.2 mL/只的剂量分别以点眼和腹腔接种的方式接种上述7种浓度的菌悬液；对照组接种0.2 mL/只的无菌生理盐水。试验期间外界条件与暂养时相同，随时观察棘腹蛙症状。出现棘腹蛙死亡即时捞出并剖检，以不再发生死亡时为结束时间。从死亡棘腹蛙眼部和内脏再次分离细菌并进行鉴定。计算出出该候选菌株感染棘腹蛙的半数致死量（LD50）。
1.2.3 生理生化特性鉴定 取上述纯化后的候选菌，接种于细菌微量生化反应管，按照常规进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、七叶苷、肌醇等项目的生理生化特性测定，实验结果主要参照《伯杰细菌鉴定手册》进行判定。
1.2.4 16S rDNA鉴定 采用扩增细菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分别为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
阳性PCR产物测定结果提交GenBank数据库进行Blast比对。利用Mega软件对与该序列类似度较高的序列进行比对并构建系统进化树。
1.2.5 药敏试验 挑取纯化后的候选菌株单个菌落于M-H肉汤中，28 ℃恒温震荡培养12 h。将培养物用生理盐水稀释为0.5倍麦氏浓度后用棉拭子蘸取菌液均匀涂布培养基表面，然后用镊子将纸片贴在琼脂平板表面。每张纸片间距≥24 mm，纸片中心距平皿边缘≥15 mm。28 ℃恒温培养12～16 h后测量抑菌圈大小并参照杭州天和微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定结果。
2 结果与分析
2.1 细菌分离结果
在剖检的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分离到一株优势菌，命名为CQWU201401。该候选菌株在LB固体培养基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出现微弱溶血环。革兰氏染色后在光学显微镜下可观察到圆形或椭圆形、葡萄状堆积排列的革兰氏阳性菌。
2.2 致病性实验结果
候选菌株接种棘腹蛙3 d后减少或停止进食，7 d后陆续有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖检可见眼部出现化脓症状，口腔和食道有轻微出血，胃部严重出血，与自然感染结果一致；从发病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分离出与候选菌株生理生化特性一致的优势菌。候选菌株的LD50值为2.5×107 CFU/只。对照组棘腹蛙无任何异常（表1）。
摘要：在患“白内障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分离到一株圆形或椭圆形、葡萄状堆积的革兰氏阳性菌，经培养特性观察和致病性实验，确定候选菌株CQWU201401为“白内障”的病原；通过针对该菌株的生理生化特性鉴定和16S rDNA测序鉴定结果判定该候选菌株为金黄色葡萄球菌。采用药敏纸片法对该菌株进行药敏试验，在10种药物中的仅对四环素有耐药现象；针对该病原菌的分离鉴定和药敏试验为临床上防治该病提供了参考。
关键词：棘腹蛙；“白内障”；分离鉴定
中图分类号：S947.2 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0008-03
棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我国特有的珍稀两栖动物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肃等省[1]。棘腹蛙个体大，肉质鲜美，营养价值高，是名贵的营养滋补食品[2，3]。由于人为滥捕、水体污染、生态环境破坏等因素，野生棘腹蛙资源日趋匮乏，种群规模不断缩小，已被《中国濒危动物红皮书》列为易危物种[4]。近段时期，重庆地区部分棘腹蛙养殖场流行了一种致棘腹蛙眼睛表面出现白色薄膜，食欲废绝，甚至导致患蛙死亡的疾病，给生产上带来了极大的损失。为解决这一问题，本研究拟分离鉴定该病的病原，并针对性的进行抗生素筛选为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
取重庆地区某养殖场数只具“白内障”典型症状的棘腹蛙作为被检病料。患病棘腹蛙体重100～120g，体长40～50cm，剖检后可见眼球外附着一层白色薄膜，眼睛巩膜部有少量出血点，舌头表层和口腔内部有散在出血点，食道、胃和肠道出血。
健康棘腹蛙80只，购自重庆市某棘腹蛙养殖场，规格为每只100 g左右。
酵母提取物、胰蛋白胨等试剂购自OXOID公司；水解酪蛋白（M-H）琼脂/肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司；兔血在无菌条件下采自健康家兔；细菌微量生化管（批号：140123）和药敏试纸（批号：140227）购于杭州天和微生物试剂有限公司；DNA分子量标准、2×Taq PCR Master Mix等购自北京天根生化科技有限公司；其他常规试剂由实验室自行配制。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 无菌蒸馏水冲洗病蛙体表后，在超净操作台中接种病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分内脏器官等于LB固体和液体培养基，28 ℃培养24 h；同时做厌氧培养，观察细菌生长情况。对分离到的细菌进行纯化培养，并用5%兔血平板鉴定溶血性；挑取单个菌落革兰氏染色镜检，纯化后的候选菌株置-20 ℃保存。
1.2.2 致病性实验 用平板菌落计数法调整菌悬液浓度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供试棘腹蛙分为8组，每组10只，暂养一周无任何病变后方可用于实验；接种组以0.2 mL/只的剂量分别以点眼和腹腔接种的方式接种上述7种浓度的菌悬液；对照组接种0.2 mL/只的无菌生理盐水。试验期间外界条件与暂养时相同，随时观察棘腹蛙症状。出现棘腹蛙死亡即时捞出并剖检，以不再发生死亡时为结束时间。从死亡棘腹蛙眼部和内脏再次分离细菌并进行鉴定。计算出出该候选菌株感染棘腹蛙的半数致死量（LD50）。
1.2.3 生理生化特性鉴定 取上述纯化后的候选菌，接种于细菌微量生化反应管，按照常规进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、七叶苷、肌醇等项目的生理生化特性测定，实验结果主要参照《伯杰细菌鉴定手册》进行判定。
1.2.4 16S rDNA鉴定 采用扩增细菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分别为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
阳性PCR产物测定结果提交GenBank数据库进行Blast比对。利用Mega软件对与该序列类似度较高的序列进行比对并构建系统进化树。
1.2.5 药敏试验 挑取纯化后的候选菌株单个菌落于M-H肉汤中，28 ℃恒温震荡培养12 h。将培养物用生理盐水稀释为0.5倍麦氏浓度后用棉拭子蘸取菌液均匀涂布培养基表面，然后用镊子将纸片贴在琼脂平板表面。每张纸片间距≥24 mm，纸片中心距平皿边缘≥15 mm。28 ℃恒温培养12～16 h后测量抑菌圈大小并参照杭州天和微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定结果。
2 结果与分析
2.1 细菌分离结果
在剖检的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分离到一株优势菌，命名为CQWU201401。该候选菌株在LB固体培养基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出现微弱溶血环。革兰氏染色后在光学显微镜下可观察到圆形或椭圆形、葡萄状堆积排列的革兰氏阳性菌。
2.2 致病性实验结果
候选菌株接种棘腹蛙3 d后减少或停止进食，7 d后陆续有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖检可见眼部出现化脓症状，口腔和食道有轻微出血，胃部严重出血，与自然感染结果一致；从发病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分离出与候选菌株生理生化特性一致的优势菌。候选菌株的LD50值为2.5×107 CFU/只。对照组棘腹蛙无任何异常（表1）。
摘要：在患“白内障”棘腹蛙眼部、口腔和胃部分离到一株圆形或椭圆形、葡萄状堆积的革兰氏阳性菌，经培养特性观察和致病性实验，确定候选菌株CQWU201401为“白内障”的病原；通过针对该菌株的生理生化特性鉴定和16S rDNA测序鉴定结果判定该候选菌株为金黄色葡萄球菌。采用药敏纸片法对该菌株进行药敏试验，在10种药物中的仅对四环素有耐药现象；针对该病原菌的分离鉴定和药敏试验为临床上防治该病提供了参考。
关键词：棘腹蛙；“白内障”；分离鉴定
中图分类号：S947.2 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2014）08-0008-03
棘腹蛙（Paa boulengeri）又名石坑、石蛙等，是我国特有的珍稀两栖动物，主要分布在湖南、湖北、四川以及甘肃等省[1]。棘腹蛙个体大，肉质鲜美，营养价值高，是名贵的营养滋补食品[2，3]。由于人为滥捕、水体污染、生态环境破坏等因素，野生棘腹蛙资源日趋匮乏，种群规模不断缩小，已被《中国濒危动物红皮书》列为易危物种[4]。近段时期，重庆地区部分棘腹蛙养殖场流行了一种致棘腹蛙眼睛表面出现白色薄膜，食欲废绝，甚至导致患蛙死亡的疾病，给生产上带来了极大的损失。为解决这一问题，本研究拟分离鉴定该病的病原，并针对性的进行抗生素筛选为临床治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
取重庆地区某养殖场数只具“白内障”典型症状的棘腹蛙作为被检病料。患病棘腹蛙体重100～120g，体长40～50cm，剖检后可见眼球外附着一层白色薄膜，眼睛巩膜部有少量出血点，舌头表层和口腔内部有散在出血点，食道、胃和肠道出血。
健康棘腹蛙80只，购自重庆市某棘腹蛙养殖场，规格为每只100 g左右。
酵母提取物、胰蛋白胨等试剂购自OXOID公司；水解酪蛋白（M-H）琼脂/肉汤购自广东环凯微生物科技有限公司；兔血在无菌条件下采自健康家兔；细菌微量生化管（批号：140123）和药敏试纸（批号：140227）购于杭州天和微生物试剂有限公司；DNA分子量标准、2×Taq PCR Master Mix等购自北京天根生化科技有限公司；其他常规试剂由实验室自行配制。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离 无菌蒸馏水冲洗病蛙体表后，在超净操作台中接种病蛙眼部病灶、口腔、腹水和部分内脏器官等于LB固体和液体培养基，28 ℃培养24 h；同时做厌氧培养，观察细菌生长情况。对分离到的细菌进行纯化培养，并用5%兔血平板鉴定溶血性；挑取单个菌落革兰氏染色镜检，纯化后的候选菌株置-20 ℃保存。
1.2.2 致病性实验 用平板菌落计数法调整菌悬液浓度至5.0×108、5.0×107、5.0×106、5.0×105、5.0×104、5.0×103 、5.0×102CFU/mL。供试棘腹蛙分为8组，每组10只，暂养一周无任何病变后方可用于实验；接种组以0.2 mL/只的剂量分别以点眼和腹腔接种的方式接种上述7种浓度的菌悬液；对照组接种0.2 mL/只的无菌生理盐水。试验期间外界条件与暂养时相同，随时观察棘腹蛙症状。出现棘腹蛙死亡即时捞出并剖检，以不再发生死亡时为结束时间。从死亡棘腹蛙眼部和内脏再次分离细菌并进行鉴定。计算出出该候选菌株感染棘腹蛙的半数致死量（LD50）。
1.2.3 生理生化特性鉴定 取上述纯化后的候选菌，接种于细菌微量生化反应管，按照常规进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、七叶苷、肌醇等项目的生理生化特性测定，实验结果主要参照《伯杰细菌鉴定手册》进行判定。
1.2.4 16S rDNA鉴定 采用扩增细菌16S rDNA的通用引物，其上、下游引物序列分别为：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
阳性PCR产物测定结果提交GenBank数据库进行Blast比对。利用Mega软件对与该序列类似度较高的序列进行比对并构建系统进化树。
1.2.5 药敏试验 挑取纯化后的候选菌株单个菌落于M-H肉汤中，28 ℃恒温震荡培养12 h。将培养物用生理盐水稀释为0.5倍麦氏浓度后用棉拭子蘸取菌液均匀涂布培养基表面，然后用镊子将纸片贴在琼脂平板表面。每张纸片间距≥24 mm，纸片中心距平皿边缘≥15 mm。28 ℃恒温培养12～16 h后测量抑菌圈大小并参照杭州天和微生物试剂有限公司的药敏试验判断标准来判定结果。
2 结果与分析
2.1 细菌分离结果
在剖检的患病棘腹蛙眼、口腔和胃分离到一株优势菌，命名为CQWU201401。该候选菌株在LB固体培养基上呈乳白色，光滑菌落。在兔全血平板上出现微弱溶血环。革兰氏染色后在光学显微镜下可观察到圆形或椭圆形、葡萄状堆积排列的革兰氏阳性菌。
2.2 致病性实验结果
候选菌株接种棘腹蛙3 d后减少或停止进食，7 d后陆续有病蛙死亡。死亡棘腹蛙剖检可见眼部出现化脓症状，口腔和食道有轻微出血，胃部严重出血，与自然感染结果一致；从发病棘腹蛙眼部、口腔和胃仍能分离出与候选菌株生理生化特性一致的优势菌。候选菌株的LD50值为2.5×107 CFU/只。对照组棘腹蛙无任何异常（表1）。
