花旗松素、槲皮素和桑色素与丙二胺桥联β-环糊精的包合作用及抗氧化活性

    迟绍明 杨松霖 晋文 杨惠文 王宇飞 雷泽 朱洪友 赵焱

    

    

    

    摘?要?黄酮类化合物花旗松素（TFL）、槲皮素（QCT）和桑色素（MH）具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗肿瘤等多种生物活性，但这些化合物水溶性差，口服利用率低，影响其药效的发挥。桥联β-环糊精（bis（β-CD）s）可通过两个环糊精空腔对客体分子的协同键合，增强环糊精对药物分子的键合能力，从而显著改善药物分子的水溶性。本研究考察了TFL、QCT和MH在溶液和固相中与丙二胺桥联β-环糊精（H2）的包合行为。通过紫外-可见吸收光光谱（UV-Vis）、一维核磁共振氢谱（1H NMR）、二维核磁共振氢谱（2D NMR）、扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等对3种包合物（TFL/H2、QCT/H2和MH/H2）进行表征。结果表明，3种黄酮類化合物的A环和C环分别从环糊精的小口端包结到H2的两个空腔中，形成1∶1夹心式的包结模式。3种包合物的稳定常数（KS）大小顺序为KMH/H2>KTFL/H2>KQCT/H2。主-客体的尺寸、形状匹配关系和氢键相互作用力，是影响包合物稳定的重要因素。形成包合物后，TFL、QCT和MH在水中的溶解度分别提高了130.2、180.4和210.1倍。此外，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法抗氧化活性实验结果表明，包合物TFL/H2、MH/H2的抗氧化活性显著增强了游离药物的活性。本研究为高水溶性、较好抗氧化活性的黄酮类化合物药物的开发提供了重要参考。

    关键词?花旗松素; 槲皮素; 桑色素; 丙二胺桥联β-环糊精;协同键合;水溶性;抗氧化活性

    1?引 言

    花旗松素（Taxifolin， TFL）、槲皮素（Quercetin， QCT）、桑色素（Morin hydrate， MH）（图1）3种黄酮是在植物中发现的天然多酚类化合物，普遍存在于水果、蔬菜、坚果、花和茶等多种植物中[1，2]。这些黄酮类化合物具有抗炎、抗肿瘤、抗增殖、抗诱变、抗动脉粥样硬化、保护心脏和肝脏、抗DNA损伤等多种生物活性[3，4]，特别是其优良的抗氧化活性，因而受到广泛关注[5]。如TFL抗氧化能力显著，效果远优于维生素C和维生素E，素有“清基之王”的美称[6];QCT对油脂在氧化过程中产生的游离基团具有接受体的功能，常被用作食品的抗氧化剂[7];MH除能直接清除自由基外，还可通过与体内一些氧化酶结合，影响其构型、构象，抑制酶的活性，从而有效抑制自由基的生成[8，9]。但TFL、QCT和MH的水溶性较差，口服生物利用度低，限制了它们在食品和制药领域中的应用。因此，开发提高这些黄酮类化合物水溶解度的方法至关重要。

    环糊精（Cyclodextrin， CD）具有疏水的内腔和亲水的外表面，能够通过主-客体包合作用，选择性键合药物分子，广泛应用于提高药物的稳定性、改善药物的水溶解度和生物利用率、降低药物的毒副作用和刺激性、控制药物的释放等领域[10～16]。然而，单修饰环糊精与大分子药物的键合常数通常较小，而通过特定链连接的桥联环糊精，两个相邻的环糊精空腔可以协同参与大分子药物的包结配位作用，从而扩展分子的键合能力，进而显著提高药物的稳定性和水溶解度。因此，拥有各种不同功能基桥联环糊精的合成及其对药物的键合作用研究也备受关注。如Liu等[17，18]合成了三乙烯四胺桥联环糊精，通过两个环糊精空腔的协同键合，将紫杉醇的水溶解度提高了2857倍，同时对K562白血病细胞的IC50值相比于紫杉醇降低了1.63倍。Menuel等[19]合成了冠醚偶联桥联β-环糊精，通过主-客体间的强键合作用将白消安的溶解度提升到10 mg/mL。本研究组近期合成了一种丙二胺桥联环糊精，包合雷公藤红素后，其水溶性提高60倍，同时，包合物对5株肿瘤细胞的毒性显著强于对照物顺铂，对正常细胞的毒副作用弱于游离药物[20]。然而，桥联环糊精对黄酮类化合物包合作用的研究较少[21]。

    本研究制备了1，3-丙二胺桥联β-环糊精（H2）与TFL、QCT和MH的3种水溶性包合物，对其性质进行了表征，探讨了H2对3种黄酮类化合物的协同键合行为、增溶作用以及抗氧化作用的影响。本研究为高水溶性、高抗氧化活性黄酮类化合物药物的开发提供了重要参考。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    UV-8000S型紫外-可见分光光度计（上海元析公司）; DRX500 型核磁共振仪（德国Bruker公司）; Nicolet IS10型红外光谱仪（美国Thermo科技有限公司）; DX-2700 型X 射线衍射仪（中国丹东浩元公司）; Flex-1000 型扫描电子显微镜（日本日立高新公司）。

    β-CD（分析纯，国药集团化学试剂公司）;1，3-丙二胺（分析纯，阿法埃莎化学有限公司）; TFL、QCT和MH（分析纯，成都曼斯特生物科技有限公司），未经纯化直接使用。对甲基苯磺酰氯（TsCl，化学纯，国药集团化学试剂公司），按文献[22]的方法纯化。其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。N，N′-二甲基甲酰胺（DMF）用CaO干燥24 h，然后再减压蒸馏后使用。以β-CD和对甲苯磺酰氯为原料，在碱性水溶液中合成了单-（6-脱氧-6-对甲苯磺酰基）-β-环糊精[23]。

    2.2?1，3-丙二胺桥联（6-氨基-6-脱氧-β-环糊精）（H2）的合成

    按文献[20]的方法合成H2。1H NMR （D2O， 500MHz， TMS）：δ 4.97～5.07 （s， 14H， H-1 of CD），δ 3.67～4.01 （m， 56H， H-3， 6， 5 of CD），δ 3.40～3.61 （m， 28H， H-2， 4 of CD），δ 2.75～2.98 （m， 4H， CCH2N）， δ 1.78～1.91 （m， 2H， CCH2C）。

    2.3?TFL/H2、QCT/H2和MH/H2包合物的制备

    TFL、QCT和MH包合物的制备采用饱和水溶液法[24，25]。分别取0.01 mmol（0.023 g） H2溶于3 mL水，0.03 mmol TFL（或QCT或MH）溶于2 mL无水乙醇中。混合后，于45℃搅拌反应48 h。干燥，以少量水溶解，使用0.45 μm纤维素膜过滤除去未反应的客体，真空干燥得淡黄色固体，即为TFL/H2、QCT/H2和MH/H2的包合物。

    2.4?Job曲线测定

    包合物的包合比用Job 曲线法测定[20，25]。由于TFL、QCT和MH客体难溶于水，所以溶剂采用无水乙醇和水的混合溶剂（体积比为3∶2），混合溶液[主体]+[客体]=3.5×10

    5 mol/L。测定其最大吸收波长λmax=295 nm（TFL）和λmax=265 nm（QCT、MH）处的吸光度值。

    2.5?紫外-可见（UV-Vis）光谱滴定实验

    保持客体的浓度为3.5×105 mol/L，分别加入不同体积的主体H2的溶液（混合溶剂为体积比3∶2的乙醇-水），使最终主体的浓度分别为0、3.5、7.0、10.5、14.0、17.5、21.0 和24.5 μmol/L， 孵育1 h后，测定溶液的紫外-可见吸收光谱。

    2.6?TFL/H2、QCT/H2和MH/H2包合物的水溶性实验

    通过饱和水溶液法测定包合物在水中的溶解度。将过量的包合物溶于含有4 mL水的离心管中，于25℃恒温2 h，其间短暂超声3次，离心分离，取上层清液得到饱和溶液，分别测量待测液在λmax=295 nm （TFL）和λmax=265 nm （QCT，MH）处的吸光度值。

    2.7?X-射线粉末衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）测试

    X-射线粉末衍射（XRD）（Cu靶kα=0.154056 nm）测定： 工作电压40 kV， 电流35 mA， 扫描步宽0.02 s， 采样时间0.2 s，起止角度为5°～50°。电子显微镜（SEM）测试的电子加速电压为5或3 kV。

    2.8?抗氧化活性测试

    通过清除稳定的自由基2，2-二苯基-1-吡啶酰肼（DPPH）的反应，测定3种黄酮类化合物及其包合物的抗氧化活性，此自由基在乙醇中的最大吸收波长λmax=517 nm[26，27]。将DPPH配制成8.6×105 mol/L的乙醇溶液。客体TFL、QCT和MH，以及包合物TFL/H2、QCT/H2和MH/H2分别用体积比为3∶2的乙醇-水混合溶剂配制成3.3×104 mol/L的待测溶液，得到客体和包合物的待测溶液。取3 mL DPPH溶液测定初始吸光度值，分别将客体待测液以第一次加10.0 μL，每次递增10.0 μL定量加入到DPPH溶液中，使客体待测液的浓度范围为1.1×106 ～1.1×105 mol/L。每加入一次，静置5 min后，测定其吸光度值，监测λmax=517 nm处的变化。包合物以同样的方法测定。抗氧化活性（%）通过公式（1）计算：

    AOactivity（%）=Acontrol-Asample）/Acontrol（1）

    其中， Acontrol代表DPPH溶液初始吸光度值， Asample代表加入待測样品后的吸光度值。

    3?结果与讨论

    3.1?Job曲线

    通过Job法测定3种黄酮类化合物与桥联环糊精H2之间的包合比。Job曲线（图2）表明，在主体H2摩尔分数为0.5时，吸光度均出现最大值，表明H2与TFL、QCT和MH之间均为1∶1包合。

    3.2?紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱滴定

    采用紫外-可见吸收光谱滴定测定主客体的包合稳定常数。如图3所示，固定H2浓度（1.05×105 mol/L），随着客体TFL浓度不断增加，H2的吸收值不断增大，在290和332 nm处呈现主峰和肩峰两个吸收带。

    290 nm处的吸收带归属于TFL中B环HOMOLUMO能级和π-π电子跃迁产生[28]，而332 nm处的吸收带源于TFL中A和C环的π-π跃迁产生[29]。同时，随TFL的加入，H2在330 nm处的吸收带轻微红移。以上结果表明，TLF与H2在溶液中形成了包合物。

    如将主体H2中的两个β-环糊精空腔视为一个主体单元[30]， 此主体（H）与客体（G）的包合过程可用方程（2）描述：

    H+GKsH·G（2）

    包合物的光谱滴定实验中， 主体的浓度一般远大于客体的浓度， 即[H]0>>[G]0。因此，包合物的稳定常数（KS）可由方程（3）计算[1， 25， 31]：

    [H]0[G]0ΔΑ=1KsΔΑ+[G]0ΔA（3）

    式中，[H]0、[G]0分别表示主体环糊精衍生物和客体分子的初始浓度，A为加入客体前后主体的光谱相对强度变化，即△A= A（有客体）A（无客体）。

    图3中的插图为[H]0[G]0/ΔA对[G]0绘制的拟合曲线，二者呈现出良好的线性关系， 再次表明H2与TFL的包合比为1∶1，同时， 由斜率和截距计算出包合物TFL/H2的稳定常数（表1）。由表1可见，由于主-客体间弱的疏水相互作用，丙二胺单修饰β-环糊精H1与3种黄酮类化合物的键合能力较低。而采用丙二胺基团将两个环糊精空腔桥连接起来后，可得到具有双重疏水结合作用和多重识别功能的丙二胺桥联β-环糊精H2，由于结合位点增加，极大地提高环糊精对客体的键合能力。H2与H1相比，对TFL、QCT和MH的包结稳定常数分别提高了4.3、11.5和1.9倍。H1和H2对黄酮分子的选择性顺序均为： MH>TFL>QCT。原因可能是由于3种黄酮类化合物虽然具有相似的结构，但MH中C环上的两个羟基位于间位，而TFL和QCT化合物C环上的两个羟基位于邻位，故MH具有更小的空间位阻，更容易嵌入到环糊精的空腔中，导致主体化合物对MH键合能力最强。同时，TFL与QCT结构相似，但比较两者的B环后发现，前者更趋近立体化，后者为一个平面结构。由于TFL中B环上的羟基向外，更易与H2桥链上的胺基形成氢键，所以主体化合物对TFL的键合能力强于QCT。上述结果表明，主-客体的尺寸、形状匹配关系和氢键相互作用力，是决定3种黄酮类化合物包合物稳定性的重要因素。

    3.3?一维核磁共振氢谱（1 H NMR）

    主客体分子在包合过程中，化学位移的变化是表征包合物的一种有效方法[32]。 图4为MH（a）、H2（b）、MH/H2（c）包合物的1H NMR谱图， MH的溶剂为CD3OD， 其它溶剂为D2O。由图4a可见，MH的特征峰主要集中在δ 6.0×106～7.8 ×106之间; 图4b中H2的特征峰主要集中在δ 3.0×106～4.0 ×106之间，在δ 6.0×106～7.0 ×106之间没有任何峰; 图4c中包合物既有H2，又有MH的特征峰。由于TFL、QCT和MH水溶性较差，当采用D2O作溶剂时几乎不溶，而其包合物在D2O中都能较好溶解，表明H2对客体具有增溶作用，初步说明包合物制备成功。由表2可知， 形成包合物后，环糊精上H1-6的化学位移均向高场移动（δ=0.02×106～0.03 ×106），其中H3和H5化学位移变化最大，达到了0.04 ×106。这可能是由于MH分子的两端分别进入H2的两个空腔，环糊精上的H3和H5与MH靠得较近，受A、C苯环环形电子流屏蔽影响，化学位移略移向高场，而H1、H2 、H4和H6在空腔外受MH的影响很小[1，33]。QCT、TFL与H2的包合情况与此类似。由此表明，已形成TFL/H2、QCT/H2和MH/H2包合物。

    3.4?二维核磁共振氢谱（2D NMR）

    旋转坐标系NOE谱，即ROESY谱，常用来检测 H-H 的空间相关， 若存在NOE， 则表示相关氢H-H较接近。因此， 常用ROESY谱推测主客体的包结模式[34～36]。图5为MH/H2包合物的2D ROESY谱图，相关峰A、B表明MH的H6'、H7'和H8'质子与H2的H5质子有着较强的相关，而与H2的H3质子有着相对较弱的相关;相关峰C表明MH的H1'、H2'和与H2的H3、H5质子相关。由于H3位于环糊精的大口端，H5位于小口端，由此推断MH的A环和C环分别从环糊精的小口端包结到两个空腔中，形成了夹心式的包结模式，如图6所示。TFL/H2、QCT/H2包合物给出了类似的包结模式。在这种模式下，黄酮类化合物的A环和C环通过主客体相互作用分别从环糊精的小口端包结到H2的两个空腔中，同时，桥链基团上的胺基与黄酮B环上的羟基或羰基存在氢键相互作用，这种双重疏水结合作用和多重识别功能，可以显著提高H2对黄酮类化合物的键合能力，从而改善其水溶解度。

    3.5?红外吸收光谱

    图7为TFL/H2包合物的红外光谱（FT-IR）图，其中a为客体分子，b为主体，c为包合物。TFL的红外谱图（图7a）由3417、1646、1607、1474、1378、1168、1136、1079和1000 cm1等主要吸收峰组成，分别归属于芳香环的ν（OH）、ν（CO）、ν（CC）;C环的δip（CH）、 δ（OOH）、δ（COC）、δip（CH）、 δip（CH）和δ（CH）。在H2的红外光谱（图7b）中，主要吸收峰出现在3415 cm1（ν（OH））、1637 cm1（ν （OH））、1147和1023 cm1（分别为H2葡萄糖单元中的ν（CO））和ν（COC））。 而TFL/H2包合物中H2的νOH）（的特征吸收峰由3415 cm1移動到3438 cm1处，且峰形也发生了变化（图7c），这可能是由于形成包合物后，环糊精小口端羟基之间的氢键被破坏，使其吸收峰红移了21 cm1。并且，包合物在800～1000 cm1 处TFL的特征吸收带强度明显减弱，而展现出H2的特征吸收带，但与H2相比，峰形的变化较明显。其它包合物中展现出了相似的结果，表明包合物制备成功。

    3.6?X-射线粉末衍射

    图8为TFL/H2包合物的X-射线粉末衍射（XRD）图，TFL（图8a）具有与晶体性质一致的衍射图，而H2（图8b）是无定型的粉末形态， TFL/H2包合物（图8c）并未展现出晶体的形态特征，而是表现出与H2更加相似的非晶体形态特征。与H2相比，TFL/H2包合物在12°、19°（2θ）区域的峰强度均有所减弱，且19°区域的峰明显变钝，同时，包合物在24°、27°（2θ）区域出现新的衍射峰，这种相对的变化，表明TFL/H2包合物形成。其它的包合物展现出了相似的实验结果。

    3.7?扫描电子显微镜分析

    由TFL、H2、TFL/H2的SEM图（图9）可见，TFL具有疏松颗粒状形态（图9A），H2呈现表面光滑的类似块状晶体形态（图9B），TFL/H2包合物为光滑平面上嵌入类似细小晶体的形态 （图9C）。QCT和MH的是针状类晶体的外形，与H2形成包合物（图略）后，在光滑表面都较均匀嵌入了细小的颗粒，形态发生了明显变化。由此可推断，TFL、QCT和MH均与H2有效形成包合物。

    3.8?包合物水溶性分析

    如表3所示，通过饱和水溶液法[25]，测得TFL、QCT、MH饱和溶液的吸光度值，代入其标准工作曲线， 得到TFL、QCT和MH在水中的溶解度，分别为20.06、12.72和12.40 g/mL。由于H1-2具有疏水的空腔和亲水的表面， 都可通过非共价键相互作用与水溶性差的客体形成包合物，使客体的水溶解度大大提高。但由于主-客体间弱的疏水相互作用，丙二胺单修饰β-环糊精H1与3种黄酮类化合物的键合能力较低，而丙二胺桥联β-环糊精H2通过两个环糊精空腔对客体分子的协同包结，从而显著提高环糊精的键合能力以及增溶能力，与H2形成包合物后，TFL、QCT和MH在水中的溶解度分别提高了130.2、 180.4和210.1倍。

    3.9?抗氧化性活性

    DPPH自由基清除法常用于评价天然抗氧化剂清除自由基的能力[27，37]。由于氢或电子供体化合物在517 nm处有吸收，通过测量此处吸光度的降低值，可测定其抗氧化活性。结果如图10所示，随着TFL、QCT、MH浓度不断增加，DPPH清除率呈现梯度增加。与H2包合后，TFL和MH的抗氧化活性显著提高。当浓度为8.8×106 mol/L时，MH/H2和TFL/H2分别为53.5%和51.7%，游离MH仅为42.0%，相应的包合物抗氧化活性均值比未包结物分别提高2.43%和5.58%。通过T检验分析数据表明，两组数据具有显著性差异（p<0.05），表明数据具有统计学意义。然而与游离的QCT相比，QCT/H2的抗氧化能力有所降低。

    抗氧化劑清除DPPH自由基的能力与其供氢能力有关[21，38]。TFL/H2和MH/H2抗氧化活性的提高可能是由于包合时，TFL、MH与H2间形成了分子间氢键，削弱了分子内氢键，有利于供氢。然而QCT化合物C环邻位上的羟基，由于空间位阻作用只能部分进入到CD空腔中，形成较弱的包合物，从而削弱了QCT与H2之间的氢键相互作用，包合物的抗氧化活性有所降低。由此可见，桥联环糊精H2对TFL、QCT、MH键合模式的强弱会影响到这些黄酮类化合物的抗氧化活性。

    4?结 论

    制备了丙二胺桥联环糊精H2与TFL、QCT、MH的3种水溶性较好、摩尔比为1∶1的包合物。研究表明，H2通过两个环糊精空腔对客体分子的协同包结，从而提高了环糊精对3种黄酮类化合物的键合能力，进而显著改善TFL、QCT、MH的水溶性。抗氧化活性分析表明，H2通过包合作用增强了TFL、MH的抗氧化能力。本研究为获得新型高水溶性、较好抗氧化活性的黄酮类化合物提供了一条可行的途径，其在食品、农业和医疗保健品等领域有潜在的应用价值。

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    34?DENG Ying-Hui， SU Li-Na， PANG Yan-Hua， GUO Ya-Fei， WANG FEN， LIAO Xia-Li， YANG Bo. Chinese J. Anal. Chem.，2017， 45（5）： 648-653

    鄧颖慧， 苏丽娜， 庞艳华， 郭亚飞， 王 芬， 廖霞俐， 杨 波. 分析化学，2017， 45（5）： 648-653

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    赵 芳， 赵雪秋， 常 清， 王淑慧， 杜 瑶， 杨丽娟.分析化学，2017， 45（10）： 1547-1555

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    Inclusion and Antioxidant Properties of Taxifolin， Quercetin and Morin

    Hydrate with Diaminopropane Bridged Bis（β-cyclodextrin）s

    CHI Shao-Ming1， YANG Song-Lin1， JIN Wen1， YANG Hui-Wen1， WANG Yu-Fei1，

    LEI Ze2， ZHU Hong-You2， ZHAO Yan*1

    1（College of Chemistry and Chemical Engineering， Yunnan Normal University， Kunming 650500， China）

    2（Guangdong Goodscend Pharmaceutical Technology Co.， Ltd， Shantou 515098， China）

    Abstract?Taxifolin （TFL）， quercetin （QCT） and morin hydrate （MH） are common flavonoids in nature. They have many biological activities， such as antioxidant， anti-inflammatory， anti-allergic， anti-tumor and so on， but these compounds have poor water solubility and low oral utilization rate， which hinder the pharmacological action of these compounds. The bridged bis（β-cyclodextrin）s （bis（β-CD）s） has been known as it can significantly alter the molecular binding ability and the water solubility toward drug molecules， through the cooperative binding of drug molecule by two hydrophobic cavities located in close vicinity. In this work， the inclusion behavior of TFL， QCT and MH with diaminopropane bridged bis （β-CD）s） （H2） in solution and solid phase was studied. The three inclusion complexes （TFL/H2， QCT/H2 and MH/H2） were characterized by ultraviolet visible spectrum （UV-VIS）， 1H nuclear magnetic resonance spectrum （1H NMR）， two-dimensional nuclear magnetic resonance spectrum （2D NMR）， scanning electron microscope （SEM）， X-Ray diffraction spectrum （XRD） and Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR）. The results showed that the A ring and C ring of the three flavonoids were separately included in two β-CD cavities from narrow side of H2， forming a 1∶1 cooperative sandwich binding mode. The order of stability constant （KS） of the three inclusion complexes was KMH/H2>KTFL/H2>KQCT/H2. The inclusion complex stability depended greatly on the host-guest size， shape matching relation and hydrogen bond interaction force. After the formation of inclusion complex， the solubility of TFL， QCT and MH in water increased by 130.2， 180.4 and 210.1 times， respectively. In addition， the antioxidant activities were determined by 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazide （DPPH） radical scavenging method. Excitingly， the antioxidant activities of TFL/H2and MH/H2 inclusion complexes presented a satisfactory antioxidant activity， which was even higher than that of free drugs. The study provided an important reference for the development of flavonoids with high water solubility and good antioxidant activity.

    Keywords?Taxifolin; Quercetin; Morin hydrate; Diaminopropane bridged bis（β-cyclodextrin）s; Cooperative bonding; Water solubility; Antioxidant activity

    （Received 16 September 2019; accepted 21 November 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos.21362046， 21062030） and the Yangfan Innovative and Entepreneurial Research Team Project （No. 201312S09）.