纳米铁氰化钴电化学传感器检测细胞释放的超氧阴离子

    崔敏 温晓芳 任聚杰 张聪 李娜 韩元元 余旭东 籍雪平

    

    

    

    摘?要?采用共沉淀方法制备的铁氰化钴（Co3[Fe（CN）6]2）和Hummers法制备的还原氧化石墨烯（RGO）共沉积修饰玻碳电极（GCE），制备了无酶型超氧阴离子（O·-2）电化学传感器（Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE）。采用扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、电化学交流阻抗法（EIS）、循环伏安法（CV）等研究了复合材料Co3[Fe（CN）6]2-RGO的特征及其对水中O·-2的电化学检测的可行性，分析了Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE 检测O·-2的作用机理。传感器对O·-2浓度的检测范围为0.5～30 μmol/L，灵敏度为 91.8 μA L/（μmol cm2）， 检出限为0.071 μmol/L（S/N = 3），而且具有良好的选择性，H2O2、O2及其它体内电化学活性物质均不干扰O·-2的测定，成功地应用于MCF-7细胞中释放的O·-2的电化学检测。此传感器在病理和生物学领域定量测定O·-2方面具有潜在的应用价值。

    关键词?电化学传感器; 超氧阴离子; 铁氰化钴; 还原氧化石墨烯; MCF-7细胞

    1?引 言

    超氧阴离子自由基（O·-2）是活性氧的重要组成部分，与很多生理和病理过程密切相关。在正常的生理条件下，O·-2在体内保持相对平衡的状态，当细胞受到外界刺激或者发生病变，会产生过量O·-2，造成DNA损伤，从而影响基因的表达，导致衰老、恶性肿瘤和一些神经性疾病，如帕金森病等[1，2]。因此，建立实时、准确、简便、快速的O·-2检测技术，对于研究机体的生理和致病机理具有重要的意义。

    常见的检测O·-2的方法有电子自旋共振法[3，4]、分光光度法[5，6]、化学发光法[7，8]、色谱法[9，10]、荧光法[11，12]和电化学法[13～19]等。由于O·-2的活性高、半衰期短，虽然常规方法也能检测O·-2，但相对而言，电化学仪器比较便宜，操作简单，易于实现实时、在体监测，因此在定量分析活体细胞中O·-2方面具有优势[13]。

    已报道的O·-2电化学传感器按敏感单元是否使用酶可分为有酶型[14～16]和无酶型[17～20]。有酶型传感器的选择性通常较好，但缺点是天然酶易受外界条件影响而性能不稳甚至失活，导致所构建的传感器稳定性和重现性差、寿命较短。无酶型传感器多采用新型无机纳米材料或人工合成的有机材料，这些修饰材料不仅具有良好的催化性、生物相容性、强的电子转移能力等优点，而且制作成本低、稳定性好，能克服天然酶易失活、易受外界条件影响等缺点，增强传感器的稳定性，延长传感器的使用寿命，所以无酶型O·-2电化学传感器备受关注[21～23]。Liu等[21]采用氮掺杂中空介孔碳球修饰的丝网印刷碳电极检测超氧阴离子，Kim等[18]利用Pt共价键合的多壁碳纳米管（MCNTs）复合材料电化学检测O·-2，虽然这些电极都能高效定量分析O·-2，但没有探讨对O·-2检测的作用机理。Liu等[17，22]利用Ag纳米颗粒与功能化的MCNTs的复合物检测O·-2，通过检测O·-2歧化反应生成的O2，间接定量分析O·-2的浓度，这可能会受到生物体内其它来源O2的影响。研究者采用磷酸锰（Mn3（PO4）2）自组装的纳米表面检测O·-2[23，24]，由于加入O·-2，引起Mn3（PO4）2自身的氧化还原峰电流的变化，通过这种变化检测O·-2，避免了体内其它来源的H2O2和O2产生的干扰。也有研究者采用相同的机理建立了检测O·-2的方法[25，26]。

    过渡金属铁氰化物 （MHCFs） 是一类以过渡金属为中心的无机配位化合物，由过渡金属中心离子和氰根基团配体构成，是一种最古老、最简单的金属有机框架化合物[27]，而且过渡金属（M）有多种价态，以MHCFs作为敏感材料，可以实现对O·-2的高选择性检测，且不受H2O2和O2干扰。石墨烯是一种由单层sp2杂化碳原子组成的蜂窝状结构的二维碳纳米材料[28，29]，由于构成还原氧化石墨烯（RGO）结构的碳原子都处于sp2杂化态，额外的p轨道可以形成大的共轭π键，并且π电子可以自由移动。因此，RGO具有优异的导电性、大的比表面积和良好的生物相容性，被广泛应用于电子器件、电化学传感器等领域[28～31]。

    本研究以CoHCFs為敏感材料，与导电性良好的RGO形成复合材料，构建了无酶型O·-2电化学传感器，并探究了O·-2的检测机理。此传感器不受H2O2和O2干扰，具有良好的选择性、灵敏度、稳定性和重现性。研究表明，CoHCFs对O·-2具有高催化活性，是非常有潜力的无酶型O·-2电化学传感器敏感材料。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    CHI760E电化学工作站（上海辰华仪器公司）; BT125D电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）; PHS-2F pH计（雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司）; HITACHI S-4800扫描电子显微镜（SEM，日本日立公司）; UV-5200PC紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

    超氧化钾（KO2）、二甲基亚砜（DMSO）、18-冠醚-6（阿拉丁试剂公司）; 乙酸钴、聚乙烯基吡咯烷酮（天津大茂化学试剂公司）; KCl、Na2HPO4、NaH2PO4、K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]（天津永大化学试剂公司）; 葡萄糖（Glu）、尿酸（UA）、多巴胺（DA）、抗坏血酸（AA）、H2O2（天津博迪化工股份有限公司）。 所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

    2.2?Co3[Fe（CN）6]2的制备[32]

    A溶液： 0.075 mmol Co（CH3COO）2·4H2O溶于10 mL水中; B溶液： 0.04 mmol K3[Fe（CN）6]和0.3 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在剧烈搅拌下溶于10 mL水中，得到透明溶液。在磁力搅拌下， 将A溶液用注射器缓缓滴加到B溶液中，磁力搅拌10 min后，静置24 h，离心分离， 得到红色沉淀Co3[Fe（CN）6]2·10H2O，水洗数次，在干燥箱中40℃烘干。

    2.3?RGO的制备

    利用Hummers法制备氧化石墨烯（GO）[30]。取2.0 g氧化石墨烯，溶于20 mL水中，超声分散均匀。取0.3 g NaBH4溶于10 mL乙醇中，缓慢滴加上述液体，搅拌24 h，水洗数次，得到RGO，冻干。

    2.4?修饰电极的制备

    将玻碳电极分别用粒径1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3粉打磨，每次打磨后依次用水、乙醇、水超声清洗，氮气吹干，备用。将1 mg/mL Co3[Fe（CN）6]2溶液和1 mg/mL RGO悬浮液按体积比2∶1配成混合液。取8 μL混合液滴涂在处理好的玻碳电极上，在空气中干燥，得到修饰电极Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE。

    2.5?超氧阴离子（O·-2）的产生[?14]

    将0.0147 g KO2溶解在2 mL 18-冠醚-6的DMSO溶液（含有0.4 nm分子筛），超声处理5 min。由于DMSO溶液中O·-2在271 nm 处的摩尔吸光系数为2006 L/（mol cm），本研究采用紫外-可见分光光度计估算DMSO溶液中O·-2的浓度[33]。

    2.6?电化学测试

    电化学检测采用三电极体系： 铂丝为对电极，银-氯化银电极（Ag/AgCl）为参比电极，玻碳电极（直径3 mm）或修饰后的玻碳电极为工作电极。电化学阻抗（EIS）测试是在含5 mmol/L [Fe（CN6）]3/4的0.1 mol/L KCl溶液中进行，振幅为5 mV，频率为0.1～105 Hz。循环伏安（CV）测试在0.05 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（PBS， pH 7.4）中进行，电压范围0～0.9 V。

    3?结果与讨论

    3.1?材料表征

    采用XRD对制备的过渡金属铁氰化物进行了表征，由图1C可见，制备的材料的XRD图的峰位置与Co3[Fe（CN）6]2·10H2O标准卡片上的峰位置高度吻合，说明其为带有10个结晶水的Co3[Fe（CN）6]2。采用扫描电子显微镜（SEM）对制备好的Co3[Fe（CN）6]2和Co3[Fe（CN）6]2-RGO的形貌进行了表征，如图1A和图1B所示，Co3[Fe（CN）6]2呈现出均匀分布，且粒径大小约100 nm的正立方体结构，薄纱状的RGO包裹在Co3[Fe（CN）6]2表面，表明两种材料成功复合在一起。

    图1D为修饰电极在0.05 mol/L PBS中的CV图，在0～0.9 V的电化学窗口下，裸GCE（曲线a）和RGO/GCE（曲线b）都未出现氧化还原峰，修饰Co3[Fe（CN）6]2后的CV曲线（曲线c）出现了一对氧化还原峰，这是由于Co3[Fe（CN）6]2在电极上发生了氧化还原反应; 修饰了Co3[Fe（CN）6]2-RGO复合材料的CV曲线（曲线d）上的氧化还原峰电流值更大。可能有两个原因： 一方面，由于RGO的导电性好，加入RGO后，导电性增强，导致峰电流变大; 另一方面，由于RGO的比表面积大，使较多的Co3[Fe（CN）6]2修饰到电极上，增强了电流响应信号。

    电化学阻抗谱（EIS）是探测修饰电极表面特征的简便有效的方法之一，可用于描述电极的界面特性[34]。图1E是以[Fe（CN）6]3/4作为电化学探针的不同修饰电极的Nyquist图。通过ZSimpWin软件拟合Nyquist图，等效电路如图1E左上方插图所示，Rs为未补偿的电阻，Rct为电子转移电阻，Zw为Warburg阻抗，Cd为双电层电容[35，36]。 高频区的半圆直径大小对应Rct，裸玻碳电极（曲线a）的Rct≈200 Ω，电极上修饰了Co3[Fe（CN）6]2后（曲线c），Rct增大，约为1700 Ω，说明Co3[Fe（CN）6]2并不利于电子的传递。但是，裸玻碳电极上修饰RGO后，Nyquist图（曲线b）几乎是一条直线，Rct明显降低，说明RGO具有很好的导电性，可以提高电子转移速率。当RGO和Co3[Fe（CN）6]2一起修飾到电极上（Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE，曲线d）， Rct≈120 Ω，与只修饰Co3[Fe（CN）6]2相比，Rct大幅降低，说明RGO与Co3[Fe（CN）6]2的复合，增加了材料的导电性，使制备的电极Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE具有良好的导电性能，更有利于电子转移，有利于提高传感器的灵敏性。

    3.2?可行性分析

    采用循环伏安法（CV）考察了Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE电极检测O·-2的可行性。图2为在0.05 mol/L PBS （pH 7.4）中加入不同浓度O·-2时的CV曲线。当PBS中加入O·-2时，CV曲线（曲线a）出现一对可逆的氧化还原峰，这是修饰在电极上的Co3[Fe（CN）6]2本身的氧化还原峰（反应方程式（1）、（2）所示）。在PBS中未加入O·-2后，氧化峰和还原峰电流都增大，且随着O·-2含量的增加而增大，尤其在0.6 V附近氧化峰电流值增大比较明显。这是由于加入的O·-2与CoⅢ[FeⅢ（CN）6]反应，使CoⅢ还原成CoⅡ，如反应方程式（3）所示，再加上CoⅢ被电还原的CoⅡ（反应方程式（1）），使电极CoⅡ的量增加，施加正电位时（正扫），就会有较多的CoⅡ被电氧化为CoⅢ（反应方程式（3）），从而使氧化峰电流增大。所以，可以利用CV曲线上氧化峰电流的变化定量分析O·-2。由于本研究通过检测Co3[Fe（CN）6]2本身的氧化峰定量分析O·-2，所以不受H2O2和O2的干扰，后面的抗干扰实验也证明了这一点。以上实验说明，所制备的电极Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE可用于检测O·-2。

    CoⅢ[FeⅢ（CN）6]?+K++ e

    K CoⅡ[FeⅢ（CN）6]（1）

    K CoⅡ[FeⅢ（CN）6]CoⅢ[FeⅢ（CN）6]?+K++ e

    （2）

    CoⅢ[FeⅢ（CN）6]?+ O·-2+K+ K CoⅡ[FeⅢ（CN）6]?+O2（3）

    由于本研究是利用Co3[Fe（CN）6]2本身的氧化还原峰的变化检测O·-2，所以单位电极面积上修饰的Co3[Fe（CN）6]2越多，理论上效果越好。但考虑到Co3[Fe（CN）6]2导电性较差，单位电极面积上修饰的Co3[Fe（CN）6]2过多，会阻碍电子传递速率。综合两方面的因素，考察了RGO与Co3[Fe（CN）6]2的比例及滴涂量对O·-2电流响应的影响，如图3A和3B所示。当RGO与Co3[Fe（CN）6]2的比例为1∶2、滴涂量为8 μL时，Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE电极对20 μmol/L O·-2的响应电流最大，所以本研究采用此条件制备修饰电极Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE。

    3.3?扫描速率对O·-2电化学行为的影响

    为进一步探究O·-2在Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE电极表面的反应特性，考察了扫速对Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE电极电流响应的影响。不同扫速下， Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE电极在含20 μmol/L O·-2的0.05 mol/L PBS中的CV图见图4， 氧化还原峰电流随着扫速的增大而增大（图4A），且与扫速的平方根呈线性关系（图4B），线性方程分别为：Ipa（μA）=8.13×105ν1/2（（mV/s）1/2）-248，R2=0.999; Ipc（μA）=7.49×10ν1/2（（mV/s）1/2）-220，R2=0.999，表明O·-2在Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE修饰电极上的反应是扩散控制过程。

    3.4?超氧阴离子的定量检测

    用CV方法对O·-2进行定量检测，在0.05 mol/L PBS（pH 7.4）中依次加入不同浓度O·-2，进行循环伏安扫描。CV曲线的氧化峰电流和还原峰电流都随O·-2浓度的增加而增大（图5A），氧化峰电流响应增大的更明显，所以本研究利用修饰电极的氧化峰电流与O·-2浓度的关系定量检测O·-2。如图5B所示， O·-2浓度在0.5～30 μmol/L范围内二者呈线性关系，线性方程为I（μA）=6.49c（μmol/L）+218（R2=0.993），灵敏度为91.8 μA L/（μmol cm2），检出限为0.071 μmol/L（S/N=3）。与其它已报道的不同修饰电极对O·-2检测性能相比，本研究制备的传感器对O·-2的检测性能良好（表1），这是因为Co3[Fe（CN）6]2能与O·-2快速反应，且RGO大的比表面积增加了修饰电极上的Co3[Fe（CN）6]2的固定量及化学活性位点，以及ROG良好的导电性加大了Co3[Fe（CN）6]2的电子转移，使传感器具有较高的灵敏度和较低的检出限。

    本工作 This work考察了修饰电极的选择性（图6A）。选择了在生物体系中可能会对O·-2的检测有干扰的物质，包括尿酸（UA）、葡萄糖（Glu）、抗坏血酸（AA）、多巴胺（DA）、H2O2，50倍O·-2浓度的这些干扰物与O·-2共存时产生的电流响应，为没有干扰物时的响应的91.6%～94.9%，说明这些物质都不对O·-2的检测造成干扰，修饰电极具有良好的选择性，有望应用于实体细胞内O·-2的检测。

    在相同条件下， 制备5根Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE，分别在0.05 mol/L PBS中检测其对20 μmol/L O·-2的电流响应值，相对偏差为4.4%。用同一根电极Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE检测20 μmol/L O·-2的电流响应，5次检测的相对偏差为4.7%。以上结果表明，所制备的电极Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE具有优良的重现性。将修饰电极在4℃环境中保存30 d，在此期间定期对25 μmol/L O·-2进行检测，结果如图6B所示，保存30 d后，修饰电极的电流响应值是初始响应的94.8%，说明所制备的修饰电极具有优异的稳定性。

    3.5?活体细胞中超氧阴离子的检测

    通过检测MCF-7細胞释放的O·-2考察修饰电极的实时检测性能。采用本传感器检测MCF-7细胞释放的O·-2。在含有1.0×106个细胞的5 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）中，注射0.24 mg/mL酵母聚糖A，以刺激MCF-7细胞产生O·-2，由O·-2的电流响应值可以求得刺激MCF-7细胞产生的O·-2为4.90 μmol/L。当PBS中只有酵母多糖A或只有MCF-7细胞时，都没有电流响应，说明电极检测到的是细胞MCF-7被刺激后产生的O·-2，此电极能对O·-2进行实体检测。5 mL 0.01 mol/L PBS中1.0×106 cells/mL细胞MCF-7受刺激所产生的O·-2的加标回收率见表2，回收率为98.5%～106.0%，相对标准偏差为3.75%～4.31%，表明所制备的传感器能够用于实体细胞中被刺激后产生的O·-2的测定。

    4?结 论

    基于Co3[Fe（CN）6]2和RGO构建了一种新型无酶超氧阴离子电化学传感器，并成功定量测定了活体细胞受激下产生的O·-2浓度。Co3[Fe（CN）6]2作为传感器的敏感元件，利用其本身的氧化还原反应峰电流随加入O·-2浓度的改变而改变的特性定量分析O·-2浓度，且不受O2和H2O2的干扰。RGO作为电极支撑材料，由于其良好的导电性，增强了传感器的电子传导，同时由于其大的比表面积使更多的Co3[Fe（CN）6]2固定在电极表面，提高了Co3[Fe（CN）6]2的稳定性及传感器的电催化性能。由于复合材料Co3[Fe（CN）6]2-RGO的这种协同效应，使制备的电化学传感器具有优良性能，灵敏度为91.8 μA L/（μmol cm2）， 检出限为0.071 μmol/L（S/N=3），具有良好的选择性、稳定性和重现性等，并实现了对刺激后MCF-7细胞所产生的O·-2浓度的检测。所制备的超氧阴离子电化学传感器在监测O·-2浓度方面具有良好的应用前景。

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    Electrochemical Detection of Superoxide Anion Released

    from Living Cells Using Nano Cobalt Ferricyanide

    CUI Min1， WEN Xiao-Fang1， REN Ju-Jie*1， ZHANG Cong1， LI Na1，

    HAN Yuan-Yuan1， YU Xu-Dong1， JI Xue-Ping*2

    1（Department of Chemistry， School of Sciences， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang 050018， China）

    2（Department of Medical Chemistry， Hebei Medical University， Shijiazhuang 050017， China）

    Abstract?A non-enzymatic superoxide anion （O·-2） electrochemical sensor （Co3[Fe（CN）6]2-RGO/GCE） was fabricated by co-depositing cobalt ferricyanide （Co3[Fe（CN）6]2） prepared by coprecipitation method and reduced graphene oxide （RGO） prepared by Hummers method on a glassy carbon electrode （GCE）. The characteristics of Co3[Fe（CN）6]2-RGO nanocomposites and the possibility for electrochemical detection of O·-2 were studied using scanning electron microscopy （SEM）， X-ray diffraction （XRD）， electrochemical impedance spectroscopy （EIS） and cyclic voltammetry （CV）. The mechanism of Co3[Fe（CN）6]2-RGO for O·

    2 detection was investigated in this work. The sensor had a sensitivity of 91.8 μA L/（μmol cm2） and a detection limit of 0.071 μmol/L （S/N = 3）. Besides， it had excellent selectivity and could avoid the interference of hydrogen peroxide， oxygen and other electrochemical active substances in vivo. It was successfully applied to the electrochemical detection of superoxide anions in stimulated MCF-7 cells. The sensor had potential application for quantifying superoxide anions in the field of pathology and biology.

    Keywords?Electrochemical sensor; Superoxide anion; Cobalt ferricyanide; Reduced graphene oxide; MCF-7 cells

    （Received 12 October 2019; accepted 6 December 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81872669） and the Research Foundation of Education Department of Hebei Province of China （Nos. ZD2018037， QN2019140）.