人参皂苷Rg1调节沉默信息调节因子1对抗晶状体上皮细胞衰老的影响

    王浩 邹茜

    

    

    

    摘要 目的：观察人参皂苷Rb1是否通过调节沉默信息调节因子1（SIRT1）表达抗晶状体上皮细胞衰老。方法：构建晶状体上皮细胞株SRA01/04衰老模型，加入人参皂苷Rb1培养后通过PCR检测SIRT1的表达改变，通过β-半乳糖苷酶染色检测衰老情况。敲降正常晶状体上皮细胞株SRA01/04中SIRT1的表达后检测衰老情况，再次加入人参皂苷Rb1后通过PCR和免疫荧光观察上述指标有无改变。结果：60 μmol/L人参皂苷Rb1处理衰老SRA01/04细胞内SIRT1表达增加，差异有统计学意义（P<0.05）;SIRT1沉默后，SRA01/04细胞衰老程度明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;与SIRT1沉默组比较，SIRT1沉默同时加入人参皂苷Rb1后，SIRT1有所上升。结论：人参皂苷Rb1可以通过调节SIRT1表达抗晶状体上皮细胞衰老。

    关键词 年龄相关性白内障;晶状体上皮细胞;人参皂苷Rb1;沉默信息调节因子1;细胞衰老;凋亡;炎证;氧化损伤

    Abstract Objective：To observe whether ginsenoside Rb1 can inhibit senescence of lens epithelial cells by regulating expression of SIRT1.Methods：Senescence model of lens epithelial cell line SRA01/04 was established，and cultured with adding ginsenoside Rb1.The mRNA expression of SIRT1 was detected by PCR and the degree of senescence were detected by β-galactosidase staining positive rate.The expression of SIRT1 in the normal lens epithelial cell line SRA01/04 was knocked down to detect aging，and then ginsenoside Rb1 was added again to observe whether the above indicators have changed by PCR and immunofluorescence.Results：60 μmol/L ginsenoside Rb1 treatment of senescent SRA01/04 cells increased the expression of SIRT1 （P<0.05）; after silencing SIRT1，SRA01/04 cells senescence significantly increased （P<0.05）; compared with the silence SIRT1 group，after silencing SIRT1 simultaneously adding ginsenoside Rb1，SIRT1 increased.Conclusion：Ginsenoside Rb1 can resist the senescence of lens epithelial cells by regulating the expression of SIRT1.

    Keywords Age-related Cataract; Lens Epithelial Cells; Ginsenoside Rb1;SIRT1; Cell senescence; Apoptosis; Inflammation; Oxidative damage

    中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.013

    年龄相关性白内障（Age-related Cataract，ARC）是我国乃至全球范围内首位致盲性眼病[1]。随着社会的老龄化增加，ARC的患病率也随之增高，将成为社会的一大经济负担。尽管手术仍然是唯一有效的白内障治疗方法，但仍存在术后近远期的并发症[2]。因此研究ARC的病因和发病机制用于指导临床药物开发对其防治有着重要意义。ARC是复杂性多因素疾病，是环境和遗传因素共同作用下的结果。晶状体上皮细胞（Lens Epithelial Cells，LECs）是晶状体的代谢活跃中心，是ARC病理生理过程的关键细胞。目前普遍认为LECs的氧化损伤导致细胞衰老是ARC发生发展最重要的因素[3]。

    沉默信息调节因子1（Silent Information Regulation 1，SIRT1）是一种参与调控细胞衰老的高度保守的生物酶，被称为“抗衰老酶”。SIRT1通过结合P53蛋白并使去乙酰化从而负性调节其活性减缓细胞衰老[4]。SIRT1还参与调节转录因子FOXO1的活性等细胞衰老相关信号通路[5]。

    人参皂苷Rb1是人参中含量最多的成分，在调节机体免疫力、抗炎、抗氧化、抗衰老等方面发挥着重要作用。已有研究报告显示人参皂苷Rb1可通过SIRT1/核因子κB信号通路抑制高糖处理的H9C2细胞的凋亡与炎症反应[6]，可以通过调控SIRT1/eNOS/NO信号通路抵抗人脐静脉内皮细胞衰老[7]，还可以通过调控MAPK/PKA-LKB1细胞信号通路抑制紫外线诱导的细胞增殖[8]。本研究拟建立晶状体上皮细胞SRA01/04衰老模型，探讨人参皂苷Rb1是否能够延缓SRA01/04细胞衰老，并从调控SIRT1作用方面探讨人参皂苷Rb1对晶状体上皮抗衰老方面的影响。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 细胞 细胞采用人类晶状体上皮细胞株SRA01/04，购自中国科学院。

    1.1.2 药物 人参皂苷Rb1购自普菲德（中国成都）。

    1.1.3 试剂与仪器 人参皂苷Rb1（普菲德公司，成都，货号：41753-43-9）;胎牛血清（GIBCO公司，澳洲，货号：10099-141）;TRIzol试剂（Invitrogen公司，美国，货号：15596026）;转染试剂盒（Invitrogen公司，美国，货号：11668-027）;逆转录试剂盒（TaKaRa公司，日本，货号：RR036A）;荧光定量试剂盒（Thermos fisher公司，美国，货号：4376598）;兔抗SIRT1、GAPDH多克隆抗体（Abcam公司，美国，货号：ab189494，ab9485）;SIRT1小干扰RNA（siSIRT1，锐博生物科技有限公司）。

    1.2 方法

    1.2.1 分组与模型制备 将SRA01/04衰老模型分为对照组;20 μmol/L;40 μmol/L;60 μmol/L和80 μmol/L人参皂苷Rb1组。常规培养SRA01/04细胞传至2～3代后，按每孔5×105个细胞接种至24孔板中。加入50 μmol/L的过氧化氢（H2O2），继续培养后收取细胞。进行细胞形态、衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescenceβ-Galactosidase）染色，当染色比较稳定时，即为本实验中SRA01/04细胞的衰老模型。

    1.2.2 给药方法 将不同浓度的人参皂苷Rb1分别加入细胞培养液中，同等条件下培养48 h后观察细胞形态及β-半乳糖苷酶染色阳性率选择最宜浓度。

    1.2.3 检测指标与方法

    1）探讨人参皂苷Rb1抗SRA01/04细胞衰老的最佳浓度：

    将不同浓度的人参皂苷Rb1分别加入细胞培养液中，同等条件下培养48 h后观察细胞形态及β-半乳糖苷酶染色阳性率选择最宜浓度。

    2）探讨人参皂苷Rb1抗SRA01/04细胞衰老的机制：

    在SRA01/04细胞生长至60%～70%时进行转染。分为对照组、siSIRT1组、人参皂苷Rb1组、siSIRT1+人参皂苷Rb1组。转染后加入80 μmol/L人参皂苷Rb1继续培养。各组在相同培养时间后，检测SIRT1的表达。RNA干扰序列是由锐博生物科技有限公司设计合成。

    3）qRT-PCR法检测SIRT1表达量：

    用TRIzol法提取各组细胞的RNA，测定RNA的纯度和浓度;按照TaKaRa试剂盒说明书逆转录为cDNA。选取SIRT1（assay ID：Hs01009006_m1），以人GAPDH（Hs02786624_g1）作為内参，加入TaqMan Expression Master Mix（Thermos fisher），用ABI公司的step-one型实时PCR仪分析，通过检测荧光信号，比较SIRT1和内参基因的Ct值，最后用2-△△Ct分析相关基因的表达情况。该实验对每个样本重复做3次。

    4）免疫荧光：

    在培养板中加入小圆片用于细胞爬片，经过4%的多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100室温通，BSA室温封闭后，每张小圆片滴加50 μL一抗，放入湿盒4 ℃过夜。PBS清洗，擦干多余液体，滴加荧光二抗，放入湿盒室温孵育1 h，PBS浸洗，滴加Hochest进行染核，PBS清洗。封片后在荧光显微镜下采集图像。

    1.3 统计学方法

    采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间以单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 SRA01/04细胞衰老模型的建立与验证

    加入H2O2组衰老模型组的细胞形态由短胖变细长，并出现生长缓慢、贴壁细胞减少等衰老改变。见图1。

    2.2 人参皂苷Rb1抗衰老的最佳浓度

    在SRA01/04细胞衰老模型中加入不同浓度（20、40、60和80 μmol/L）的人参皂苷Rb1进行培养，48 h后观察β-半乳糖苷酶染色情况。结果显示，与对照组（0 μmol/L）比较，加入了人参皂苷Rb1的SRA01/04细胞，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），其中以60 μmol/L组效果最佳。见图2。

    2.3 人参皂苷Rb1通过SIRT1抗SRA01/04细胞衰老

    分为正常SRA01/04细胞组，SRA01/04衰老模型组，加入不同浓度（20、40、60和80 μmol/L）人参皂苷Rb1组。提取各组总RNA并检测SIRT1的表达。结果显示除了正常SRA01/04细胞中SIRT1最高外，与不加入人参皂苷Rb1组比较，加入了人参皂苷Rb1的衰老模型SRA01/04细胞SIRT1的表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），以60 μmol/L人参皂苷Rb1组最明显。见图3。

    2.4 免疫荧光验证人参皂苷Rb1通过SIRT1抗SRA01/04细胞衰老

    检测SRA01/04衰老模型及同时加入60 μmol/L人参皂苷Rb1后SIRT1中的表达。与不加入人参皂苷Rb1组比较，加入人参皂苷Rb1组（60 μmol/L）SIRT1比SRA01/04衰老模型高。见图4。

    2.5 沉默SIRT1以及同时加入人参皂苷Rb1对SIRT1表达的影响

    SIRT1沉默后SIRT1水平显著下降，差异有统计学意义（P0.05）;同时SIRT1沉默及加入60 μmol/L人参皂苷Rb1组的SIRT1水平仅表现为轻度降低，较SIRT1沉默组明显提高。见图5。

    3 讨论

    ARC的病因和发病机制至今仍不清楚。目前手术仍是主要治疗手段，但手术远期效果不佳[9]。因此研究其病因和发病机制用于指导药物开发对ARC的防治有着重要意义。在众多ARC病因的假说中，LECs的DNA氧化损伤假说较为公认[3，10-11]。紫外线和过氧化氢（H2O2）等外源性刺激可以引起DNA损伤，同时，可诱导细胞衰老，导致年龄相关性疾病的发生[12-14]。目前关于衰老的学说有很多种，最常见的包括自由基、DNA损伤、端粒酶和炎症反应。SIRT1可通过参多种途径参与抗细胞衰老，包括调节代谢和炎症反应等[15-17]。本研究发现，60 μmol/L人参皂苷Rb1能明显上调SIRT1表达，延缓晶状体上皮细胞衰老。

    在中国，人参历来被视为百草之王，其应用已有数千年。中医认为，人参具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津，安神等作用。有研究发现，人参药理作用主要包括调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老、抵抗疲劳等，临床应用广泛，同时也可用于强身固本[18]。而人参皂苷是从人参中提炼而来，被视为人参中最重要的活性成分，因其多方面的药理作用，成为了热门的研究对象。研究已发现人参皂苷在多种细胞中均具有延缓衰老作用[19-22]。本实验研究结果显示，SRA01/04细胞衰老模型中，SIRT1表达减少，人参皂苷Rb1干预后，SIRT1表达增加，而β-半乳糖苷酶染色阳性率降低;SIRT1沉默后发现，SIRT1表达明显减少;然而，在SIRT1沉默同时加用人参皂苷Rb1，SIRT1未发生明显减少。从正反两面说明，人参皂苷Rb1可以上调SIRT1表达，延缓SRA01/04细胞衰老。

    本研究探讨了人参皂苷Rb1延缓SRA01/04细胞衰老的可能机制，结果表明人参皂苷Rb1可通过调控SIRT1延缓SRA01/04细胞衰老。但研究仍然停留在细胞层面，需要进一步在体内实验进行论证，最终用于临床防治ARC。

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    （2019-05-19收稿 責任编辑：杨觉雄）