邻苯二甲酸二丁酯的酶促降解及其转酯化反应途径
刘腾飞+张汉虞+尹辛格+储娇艳+邱乐泉
摘要：本文通过邻苯二甲酸二丁酯（DBP）诱导Arthrobacter sp. ZJUTW后，制备粗酶液，考察其对DBP的酶促降解特性，结果表明：酶促最适反应温度为30℃，最适pH为8.0，在10-30℃和pH7.0-9.0均有较好的穩定性， K+、Mn2+、Mg2+则具有激活的作用，Ca2+对酶活性无明显影响，Zn2+、Ba2+和Co2+对酶活性有轻微的抑制，Fe3+、Cu2+对酶活性有较强的抑制作用；在以甲醇溶解的DBP为底物时，根据GC-MS分析结果，推测其转酯化降解途径为DBP→邻苯二甲酸丁基甲酯（BMP）→邻苯二甲酸二甲酯（DMP）→邻苯二甲酸（PA）。
关键词：Arthrobacter sp.；邻苯二甲酸二丁酯；酶促降解；转酯化反应
中图分类号：X13 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）01-0111-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.01.064
Biodegradation of dibutyl phthalate by enzyme from Arthrobacter sp. ZJUTW and its transesterification pathway
Liu Tengfei， Zhang Hanyu， Yin Xingge，Chu Jiaoyan， Qiu Lequan
（College of Biotechnology and Bioengineering， Hangzhou Zhejiang 310032， China）
Abstract： After the Arthrobacter sp. ZJUTW was induced by dibutyl phthalate （DBP）， the crude enzyme solution was prepared and the enzymatic degradation of DBP was investigated. The results showed that the optimum reaction temperature was 30℃， The optimal pH value was 8.0， which was stable at 10-30 ℃ and pH 7.0-9.0. K +， Mn2+ and Mg2+ had an active effect. Ca2+ had no significant effect on the enzyme activity. Zn2+， Ba2+ and Co2+ Activity was slightly inhibited， Fe3+， Cu2+ strong inhibitory effect on enzyme activity； dissolved in methanol DBP as a substrate， according to GC-MS analysis， speculated that the transesterification degradation pathway DBP → butyl-methyl phthalate（BMP）→ Dimethyl phthalate （DMP） → Phthalic acid （PA）.
Keywords： Arthrobacter sp .； Dibutyl phthalate； Enzymatic degradation； Transesterification
邻苯二甲酸酯（Phthate acid esters，PAEs）是世界上广泛使用的人工合成的难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等的化工生产。已有证据表明，PAEs是一类环境内分泌干扰物，其最明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少、生殖细胞超微结构改变，且对胚胎发育有一定毒性 [1]。微生物降解被认为是自然环境中完全矿化的主要过程[2]，过去的研究中已分离到多种微生物表现出了降解邻苯二甲酸酯的能力，其中针对酯键的催化反应是一个共同的起始步骤，对起始步骤主要涉及的有酯水解反应、转酯化反应以及β氧化反应等方式[3-6]。本文研究了从杭州河道污泥中分离的一株DBP降解菌Arthrobacter sp. ZJUTW的酶促降解特性，并分析了其转酯化降解途径。
1 材料与方法
1.1 菌种
Arthrobacter sp. ZJUTW为本实验室筛选所得，保藏编号为CCTCC M2012246。
1.2 试剂
DBP（98%），购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇（HPLC级）购自天津四友精细化学品有限公司；其余试剂均为分析纯。
1.3 培养基（g/L）
K2HPO4·?H2O 1.0，NaCl 1.0，（NH4）2SO4 0.5，MgSO4·?H2O 0.4，CaCl2 0.0755，FeCl3·6H2O 0.0143，pH 7.0，115 ℃ 灭菌 30 min，加入DBP（溶于甲醇）使其终浓度为250mg/L。
1.4 方法
1.4.1 DBP降解酶的诱导与定位
将Arthrobacter sp. ZJUTW菌接种到培养基中，30℃，180rpm摇床培养48h，5000×g离心10min，收集菌体沉淀，0.02mmol/L pH 7.2磷酸缓冲液（PBS）洗涤2次后，放入DBP培养基中诱导24h，于4℃，5000×g下离心10min得到具有DBP降解能力的菌体，加入适量的PBS制成菌悬液，将菌悬液置于冰浴中进行超声破碎后于4℃，12000×g下离心30 min，分别收集上清液与细胞碎片沉淀，HPLC检测DBP降解率。
1.4.2 DBP的酶促降解特性分析
酶促反应体系为：含DBP 125mg/mL（甲醇溶解）的0.02mmol/L pH 7.2 PBS中加入适量酶液，30℃反应10min；通过改变温度、pH、金属离子等条件对Arthrobacter sp ZJUTW粗酶液的酶学特性进行分析，HPLC检测DBP降解情况，计算相对酶活力。
1.4.3 酶活力的测定及HPLC检测DBP含量
在4mL 0.02mmol/L pH 7.2的PBS（含DBP 125mg/mL）中加入适量酶液，于30℃反应10min后，沸水浴3min，冷却后加入5 mL的二氯甲烷萃取，震荡混匀后取有机相，旋转蒸发除去二氯甲烷，用1mL色谱级甲醇溶解，HPLC检测DBP含量。DBP检测方法为：采用Agilent 1100型HPLC色谱仪，色谱柱为Diamonsil C18（2）5μm 250×4.6mm，流动相为甲醇︰水= 90︰10，流速为1 mL/min，检测波长为235 nm， 进样量为10 ?L。一个酶活力单位（U）设定为在30℃下，1min内能催化1.0μmol的DBP所需的酶量。蛋白质含量测定采用Bradford法 [7]。
1.4.4 GC-MS测定DBP降解中间产物
色谱条件：色谱柱为HP-5MS（30m×250 m×0.25 m）；载气为高纯度He，载气流速1.0 mL/min；进样口温度：250℃；柱温条件：初始温度60℃，保持1 min，以60 /min升温至220 ℃，保持2 min，以5 /min升温至250 ℃，保持2 min，再以5 /min升温至280 ℃，保持3 min；进样量1 μL，不分流进样。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电离能量70eV；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃ ；全扫描（SCAN）质量范围：40 m/z～400 m/z；选择离子扫描（SIM）。
2 结果与分析
2.1 Arthrobacter sp. ZJUTW的DBP降解酶的诱导与定位
通过DBP诱导前与诱导后的Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液的降解能力的比较（表1），发现诱导前无降解能力，诱导后降解率为95%，表明该菌株对DBP的降解酶属于诱导酶，而非组成型表达。对破碎细胞不同组分的DBP降解率檢测表明（表1），细胞破碎后的上清降解率达84%，而发酵液上清无降解能力，表明该菌株对DBP的降解酶属于胞内酶。
2.2 pH对粗酶液活性及其稳定性的影响
在不同pH值的缓冲液体系中测定粗酶液活性及稳定性的影响如图1A所示，当pH为8.0 左右时酶活最高，为最适pH；在不同pH值的缓冲液体系中放置30 min后测定其相对酶活力，结果表明，在pH7.0-9.0的范围内，DBP降解酶比较稳定。
2.3 温度对粗酶液活性及其稳定性的影响
温度对粗酶液活性及其稳定性的影响如图1B所示，25-35 ℃时相对酶活力较高，最适温度为30 ℃；在10-30 ℃时，酶活力稳定性良好；当温度升高到40 ℃及以上时，酶活力稳定性较差，甚至失活。
2.4 金属离子对Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液降解DBP的影响
终浓度为10mmol/L的不同金属离子对粗酶液活性的影响表2所示，K+、Mn2+、Mg2+对酶活性具有激活作用，Ca2+对酶活性无明显影响，Zn2+、Ba2+和Co2+对酶活性具有轻微的抑制，Fe3+、Cu2+对酶活具有较强的抑制作用。
2.5 酯转化降解途径
Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液对以甲醇溶解的DBP为底物进行降解后，GC-MS检测结果显示，降解产物中出现BMP、DMP、PA，推测该降解过程中先通过DBP酯酶催化转酯化反应，将甲醇的甲基转移置换出一个丁基，形成不对称酯BMP，然后再次转移甲基置换出另一个丁基，形成DMP，其后再通过酯水解反应，形成PA，因此其酯转化降解的初始途径为：DBP→BMP→DMP→PA。
3 结论
通过对Arthrobacter sp. ZJUTW的DBP诱导和细胞破碎研究，表明该菌株的DBP降解酶为胞内的诱导酶，其粗酶液的最适pH和最适温度分别为8.0和30 ℃，在pH7.0-9.0和10-30 ℃时，降解酶活力较为稳定；K+、Mn2+、Mg2+对酶活性具有激活作用，Ca2+对酶活性无明显影响，Zn2+、Ba2+和Co2+对酶活性具有轻微的抑制，Fe3+、Cu2+对酶活具有较强的抑制作用。GC-MS分析降解产物发现，该菌株对DBP的初始降解途径为DBP→BMP→DMP→ PA。
参考文献
[1] Wang Y Y， Fan Y Z， Gu J D. Dimetbyl phtbalate ester degradation by two planktonic and immobilized bacterial consortia. Int Biodeter Biodegr， 2004， 53：93-101.
[2] Duty S M， Singh N P， Silva M J， et al.The relationship between environmental exposures to phthalates and DNA damage in human sperm using the neutral comet assay. Environ Health Perspect， 2003； 111：1164-1169.
[3] Yoshinori O， Chitose T， Koji U， et al. Transesterification in the microbial degradation of phthalte esters. Journal of health science，2011，57：293-299.
[4] Xueling W， Renxing L， Qinyun D， et al. Complete degradation of di-n-octyl phthalate by biochemical cooperation between Gordonia sp. strain JDC-2 and Arthrobacter sp. strain JDC-32 isolated from activated sludge. Journal of Hazardous Materials，2010，176：262-268.
[5] Jiaxi L， Ji-Dong G. Biodegradation of dimethyl terephthalate by Pasteurella multocida Sa follows an alternative biochemical pathway. Ecotoxicology， 2006，15： 391-397.
[6] Danielle V， Jean B. Dimethyl-phthalate hydrolysis by specific microbial esterase. Chemosphere， 2003，51：663-668.
[7] Bradford M M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem， 1976，72： 248–254.
收稿日期：2017-12-15
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY15C010002）
作者简介：刘腾飞（1993-），男，在读研究生，研究方向为环境微生物。
摘要：本文通过邻苯二甲酸二丁酯（DBP）诱导Arthrobacter sp. ZJUTW后，制备粗酶液，考察其对DBP的酶促降解特性，结果表明：酶促最适反应温度为30℃，最适pH为8.0，在10-30℃和pH7.0-9.0均有较好的穩定性， K+、Mn2+、Mg2+则具有激活的作用，Ca2+对酶活性无明显影响，Zn2+、Ba2+和Co2+对酶活性有轻微的抑制，Fe3+、Cu2+对酶活性有较强的抑制作用；在以甲醇溶解的DBP为底物时，根据GC-MS分析结果，推测其转酯化降解途径为DBP→邻苯二甲酸丁基甲酯（BMP）→邻苯二甲酸二甲酯（DMP）→邻苯二甲酸（PA）。
关键词：Arthrobacter sp.；邻苯二甲酸二丁酯；酶促降解；转酯化反应
中图分类号：X13 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）01-0111-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.01.064
Biodegradation of dibutyl phthalate by enzyme from Arthrobacter sp. ZJUTW and its transesterification pathway
Liu Tengfei， Zhang Hanyu， Yin Xingge，Chu Jiaoyan， Qiu Lequan
（College of Biotechnology and Bioengineering， Hangzhou Zhejiang 310032， China）
Abstract： After the Arthrobacter sp. ZJUTW was induced by dibutyl phthalate （DBP）， the crude enzyme solution was prepared and the enzymatic degradation of DBP was investigated. The results showed that the optimum reaction temperature was 30℃， The optimal pH value was 8.0， which was stable at 10-30 ℃ and pH 7.0-9.0. K +， Mn2+ and Mg2+ had an active effect. Ca2+ had no significant effect on the enzyme activity. Zn2+， Ba2+ and Co2+ Activity was slightly inhibited， Fe3+， Cu2+ strong inhibitory effect on enzyme activity； dissolved in methanol DBP as a substrate， according to GC-MS analysis， speculated that the transesterification degradation pathway DBP → butyl-methyl phthalate（BMP）→ Dimethyl phthalate （DMP） → Phthalic acid （PA）.
Keywords： Arthrobacter sp .； Dibutyl phthalate； Enzymatic degradation； Transesterification
邻苯二甲酸酯（Phthate acid esters，PAEs）是世界上广泛使用的人工合成的难降解有机化合物，主要用于塑料增塑剂、涂料、油漆等的化工生产。已有证据表明，PAEs是一类环境内分泌干扰物，其最明显的危害是使生殖机能下降，对动物及人类生殖系统有一定损害，可引起睾丸萎缩、精子减少、生殖细胞超微结构改变，且对胚胎发育有一定毒性 [1]。微生物降解被认为是自然环境中完全矿化的主要过程[2]，过去的研究中已分离到多种微生物表现出了降解邻苯二甲酸酯的能力，其中针对酯键的催化反应是一个共同的起始步骤，对起始步骤主要涉及的有酯水解反应、转酯化反应以及β氧化反应等方式[3-6]。本文研究了从杭州河道污泥中分离的一株DBP降解菌Arthrobacter sp. ZJUTW的酶促降解特性，并分析了其转酯化降解途径。
1 材料与方法
1.1 菌种
Arthrobacter sp. ZJUTW为本实验室筛选所得，保藏编号为CCTCC M2012246。
1.2 试剂
DBP（98%），购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇（HPLC级）购自天津四友精细化学品有限公司；其余试剂均为分析纯。
1.3 培养基（g/L）
K2HPO4·?H2O 1.0，NaCl 1.0，（NH4）2SO4 0.5，MgSO4·?H2O 0.4，CaCl2 0.0755，FeCl3·6H2O 0.0143，pH 7.0，115 ℃ 灭菌 30 min，加入DBP（溶于甲醇）使其终浓度为250mg/L。
1.4 方法
1.4.1 DBP降解酶的诱导与定位
将Arthrobacter sp. ZJUTW菌接种到培养基中，30℃，180rpm摇床培养48h，5000×g离心10min，收集菌体沉淀，0.02mmol/L pH 7.2磷酸缓冲液（PBS）洗涤2次后，放入DBP培养基中诱导24h，于4℃，5000×g下离心10min得到具有DBP降解能力的菌体，加入适量的PBS制成菌悬液，将菌悬液置于冰浴中进行超声破碎后于4℃，12000×g下离心30 min，分别收集上清液与细胞碎片沉淀，HPLC检测DBP降解率。
1.4.2 DBP的酶促降解特性分析
酶促反应体系为：含DBP 125mg/mL（甲醇溶解）的0.02mmol/L pH 7.2 PBS中加入适量酶液，30℃反应10min；通过改变温度、pH、金属离子等条件对Arthrobacter sp ZJUTW粗酶液的酶学特性进行分析，HPLC检测DBP降解情况，计算相对酶活力。
1.4.3 酶活力的测定及HPLC检测DBP含量
在4mL 0.02mmol/L pH 7.2的PBS（含DBP 125mg/mL）中加入适量酶液，于30℃反应10min后，沸水浴3min，冷却后加入5 mL的二氯甲烷萃取，震荡混匀后取有机相，旋转蒸发除去二氯甲烷，用1mL色谱级甲醇溶解，HPLC检测DBP含量。DBP检测方法为：采用Agilent 1100型HPLC色谱仪，色谱柱为Diamonsil C18（2）5μm 250×4.6mm，流动相为甲醇︰水= 90︰10，流速为1 mL/min，检测波长为235 nm， 进样量为10 ?L。一个酶活力单位（U）设定为在30℃下，1min内能催化1.0μmol的DBP所需的酶量。蛋白质含量测定采用Bradford法 [7]。
1.4.4 GC-MS测定DBP降解中间产物
色谱条件：色谱柱为HP-5MS（30m×250 m×0.25 m）；载气为高纯度He，载气流速1.0 mL/min；进样口温度：250℃；柱温条件：初始温度60℃，保持1 min，以60 /min升温至220 ℃，保持2 min，以5 /min升温至250 ℃，保持2 min，再以5 /min升温至280 ℃，保持3 min；进样量1 μL，不分流进样。
质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电离能量70eV；离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃ ；全扫描（SCAN）质量范围：40 m/z～400 m/z；选择离子扫描（SIM）。
2 结果与分析
2.1 Arthrobacter sp. ZJUTW的DBP降解酶的诱导与定位
通过DBP诱导前与诱导后的Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液的降解能力的比较（表1），发现诱导前无降解能力，诱导后降解率为95%，表明该菌株对DBP的降解酶属于诱导酶，而非组成型表达。对破碎细胞不同组分的DBP降解率檢测表明（表1），细胞破碎后的上清降解率达84%，而发酵液上清无降解能力，表明该菌株对DBP的降解酶属于胞内酶。
2.2 pH对粗酶液活性及其稳定性的影响
在不同pH值的缓冲液体系中测定粗酶液活性及稳定性的影响如图1A所示，当pH为8.0 左右时酶活最高，为最适pH；在不同pH值的缓冲液体系中放置30 min后测定其相对酶活力，结果表明，在pH7.0-9.0的范围内，DBP降解酶比较稳定。
2.3 温度对粗酶液活性及其稳定性的影响
温度对粗酶液活性及其稳定性的影响如图1B所示，25-35 ℃时相对酶活力较高，最适温度为30 ℃；在10-30 ℃时，酶活力稳定性良好；当温度升高到40 ℃及以上时，酶活力稳定性较差，甚至失活。
2.4 金属离子对Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液降解DBP的影响
终浓度为10mmol/L的不同金属离子对粗酶液活性的影响表2所示，K+、Mn2+、Mg2+对酶活性具有激活作用，Ca2+对酶活性无明显影响，Zn2+、Ba2+和Co2+对酶活性具有轻微的抑制，Fe3+、Cu2+对酶活具有较强的抑制作用。
2.5 酯转化降解途径
Arthrobacter sp. ZJUTW粗酶液对以甲醇溶解的DBP为底物进行降解后，GC-MS检测结果显示，降解产物中出现BMP、DMP、PA，推测该降解过程中先通过DBP酯酶催化转酯化反应，将甲醇的甲基转移置换出一个丁基，形成不对称酯BMP，然后再次转移甲基置换出另一个丁基，形成DMP，其后再通过酯水解反应，形成PA，因此其酯转化降解的初始途径为：DBP→BMP→DMP→PA。
3 结论
通过对Arthrobacter sp. ZJUTW的DBP诱导和细胞破碎研究，表明该菌株的DBP降解酶为胞内的诱导酶，其粗酶液的最适pH和最适温度分别为8.0和30 ℃，在pH7.0-9.0和10-30 ℃时，降解酶活力较为稳定；K+、Mn2+、Mg2+对酶活性具有激活作用，Ca2+对酶活性无明显影响，Zn2+、Ba2+和Co2+对酶活性具有轻微的抑制，Fe3+、Cu2+对酶活具有较强的抑制作用。GC-MS分析降解产物发现，该菌株对DBP的初始降解途径为DBP→BMP→DMP→ PA。
参考文献
[1] Wang Y Y， Fan Y Z， Gu J D. Dimetbyl phtbalate ester degradation by two planktonic and immobilized bacterial consortia. Int Biodeter Biodegr， 2004， 53：93-101.
[2] Duty S M， Singh N P， Silva M J， et al.The relationship between environmental exposures to phthalates and DNA damage in human sperm using the neutral comet assay. Environ Health Perspect， 2003； 111：1164-1169.
[3] Yoshinori O， Chitose T， Koji U， et al. Transesterification in the microbial degradation of phthalte esters. Journal of health science，2011，57：293-299.
[4] Xueling W， Renxing L， Qinyun D， et al. Complete degradation of di-n-octyl phthalate by biochemical cooperation between Gordonia sp. strain JDC-2 and Arthrobacter sp. strain JDC-32 isolated from activated sludge. Journal of Hazardous Materials，2010，176：262-268.
[5] Jiaxi L， Ji-Dong G. Biodegradation of dimethyl terephthalate by Pasteurella multocida Sa follows an alternative biochemical pathway. Ecotoxicology， 2006，15： 391-397.
[6] Danielle V， Jean B. Dimethyl-phthalate hydrolysis by specific microbial esterase. Chemosphere， 2003，51：663-668.
[7] Bradford M M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem， 1976，72： 248–254.
收稿日期：2017-12-15
基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（LY15C010002）
作者简介：刘腾飞（1993-），男，在读研究生，研究方向为环境微生物。
