基于二氧化锰-氧掺杂氮化碳级联催化的无酶比色检测葡萄糖研究

    朱巍然 郝楠 杨小弟 王坤

    

    

    

    摘?要?基于二氧化锰（MnO2）-氧掺杂氮化碳（OCN）复合材料，构建了一种级联催化无酶比色葡萄糖传感器。通过在OCN的分散液中化学沉淀MnO2晶体制备得到MnO2-OCN复合材料。单体MnO2具有优异的类葡萄糖氧化酶活性，能够催化葡萄糖分解产生H2O2，但类过氧化物酶活性较弱，无法充分消耗反应产生的H2O2。通过引入OCN，利用其优异的类过氧化物酶活性，可以显著促进H2O2对底物的催化氧化，使溶液变色，显著改善了对葡萄糖的检测性能。基于MnO2-OCN复合材料构建的无酶比色传感器拥有较宽的检测范围（0.05～2.00 mmol/L），检出限为23 μmol/L（S/N=3）。将此传感器用于血清样品中葡萄糖的检测，加标回收率为91.9%～94.3%。由于MnO2和OCN两种材料对底物有较强的专一性，此传感器特异性识别催化葡萄糖，特异性良好。

    关键词?二氧化锰;氧掺杂氮化碳;葡萄糖;比色法;无酶检测

    1?引 言

    糖尿病已经成为当前影响人类健康最为严重的疾病之一[1]。人血液中葡萄糖含量是表征糖尿病的主要指标参数，因此，发展快速、灵敏、简单的血液中葡萄糖含量检测方法非常必要。目前，血糖检测法包括高效液相色谱-电化学联用法[2]、荧光法[3]和比色法[4]等。在这些检测方法中，比色法因不需要昂贵仪器和复杂的检测程序，以及可以现场诊断、裸眼识别结果等优势而备受关注[5]。自纳米酶的概念被提出以来[6]，因其不仅具备类似酶的催化能力，而且具有成本低、稳定性高，以及材料易于功能化等优点，已被广泛应用于葡萄糖的比色检测[7，8]。但是，因为具有类葡萄糖氧化酶活性的纳米酶种类较少，目前的检测体系多是将具有类过氧化物酶活性的纳米酶材料和天然葡萄糖氧化酶（GOx）相结合，未彻底摆脱对天然酶的依赖，以及克服天然酶的局限[9，10]。因此，开发同时具有类葡萄氧化酶和过氧化物酶活性的纳米酶材料，实现对葡萄糖的无酶检测，具有重要的意义。

    MnO2纳米材料由于其独特的材料性能，尤其是优异的类葡萄糖氧化酶活性而备受关注[11，12]。MnO2纳米材料的晶体相和表面形貌是影响催化性能的两个重要因素，研究者对MnO2的晶体和形貌的调控进行了大量研究[13，14]。最近，Han等[15]以牛血清蛋白（BSA）为模板，制备出同时具有葡萄糖氧化酶和过氧化物酶活性的MnO2材料，实现了葡萄糖的无酶检测，但该材料的催化活性并不理想。通过与其它材料（如碳基材料或金属氧化物）混合，可进一步提高MnO2的催化性能[16，17]。本研究组制备的氧掺杂氮化碳（OCN）表现出优异的类过氧化物酶活性，其二维平面结构和含氧官能团[18]也有利于负载MnO2。将这两种材料进行结合，有望显著改善对葡萄糖的催化检测性能。

    本研究通过将具有类葡萄糖氧化酶活性的MnO2与具有类过氧化物酶活性的OCN结合，构建了级联催化无酶比色传感器，用于葡萄糖的检测。通过引入OCN，利用其优异的类过氧化物酶活性，可以促进H2O2对底物的氧化变色，显著改善对葡萄糖的催化性能，实现了对葡萄糖的快速灵敏检测。由于构成此传感器的两种材料对底物有较强的专一性，可以选择性地识别葡萄糖和过氧化氢分子，故可以实现对样品中葡萄糖的特异性检测。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    XRD-6100 X射线衍射光谱仪、UV-2450 紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）;TECNAI 10 透射电子显微镜（荷兰Philips公司）;VG Multilab 2000 X射线光电子能谱仪（美国Thermo Scientific公司）。

    D-（+）葡萄糖（≥ 99%，美国Sigma Aldrich公司）;3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（≥ 99%，TMB，上海阿拉丁公司;其它试剂至少为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm，Direct-Q UV超纯水仪，Millipore公司）;缓冲液为磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4）。

    2.2?二氧化锰-氧掺杂氮化碳（MnO2-OCN）复合物的制备

    OCN按本研究组报道方法制备[18]。将OCN在水中超声分散，然后将2 mL（0.1 mmol/L）MnAc2溶液滴加到5 mL（1 mg/mL）OCN的分散液中，室温振荡1 h，使Mn2+与OCN充分结合;最后用1 mol/L NaOH调节至pH 10，室温振荡7 h。反应结束后，产物经离心、水洗和干燥后，得到复合物MnO2-OCN，于4℃ 保存。

    2.3?葡萄糖的分析检测

    室温条件下，向2 mL的离心管中分别加入20 μL MnO2-OCN分散液、50 μL葡萄糖溶液、400 μL PBS溶液（0.1 mol/L，pH 4.0），渦旋振荡1 min，37℃下反应10 min。反应结束后，加入30 μL TMB溶液（8 mmol/L），40℃反应10 min。13000 r/min离心5 min，测定上清液在650 nm处的吸光值，按照标准曲线计算浓度。

    3?结果与讨论

    3.1?OCN 和 MnO2-OCN的表征

    OCN和MnO2-OCN的透射电子显微镜（TEM）图如图1A和1B所示，OCN呈片状二维薄层结构（图1A）;粒径约3～5 nm的MnO2纳米晶均匀地分布在OCN二维薄层表面（图1B）。制备的OCN、MnO2和MnO2-OCN纳米材料的X-射线衍射（XRD）图谱见图1C，对比发现，MnO2-OCN（曲线c）中分别在27.3°和22.5°两处出现了对应于OCN和MnO2晶体的特征衍射峰，表明MnO2-OCN已成功制备。

    XPS分析結果证实了MnO2-OCN中包含4种元素Mn、O、C和N（图2A）。图2B是Mn 2p峰的分峰拟合曲线，其中，653.9 eV处的峰归属于Mn 2p1/2的特征峰，643.4 eV和642.2 eV处的两个峰均归属于Mn 2p3/2的特征峰，这与文献[19，20]报道MnO2的XPS图谱一致，证明在MnO2-OCN复合物中，MnO2是Mn元素存在的唯一形式。另一方面，在图2C中，C 1s的宽峰被分成5个峰，归属于4个含碳官能团和碳污染[21～23];O 1s的XPS图谱（图2D）对应3种含氧官能团[24，25]，与本研究组之前的研究[18]吻合。XPS的结果进一步说明，本研究成功制备了MnO2-OCN复合材料。

    3.2?材料的催化性能研究

    以500 μL 50 μmol/L葡萄糖溶液为催化底液，TMB为显色探针，对比研究了OCN、MnO2和MnO2-OCN对葡萄糖的催化活性。如图3插图所示，加入OCN后的底液为无色的溶液（插图a）;加入MnO2后，底液由无色透明变为淡蓝色（插图b）;而加入MnO2-OCN后，底液则呈现更深的蓝色（插图c），

    系列颜色的差异应归因于TMB被氧化后产生的蓝色氧化态TMB （oxTMB）量的不同。吸收光谱（图3）结果表明，随着不同材料的加入，650 nm处oxTMB的特征吸收峰的吸收强度差异明显，表明OCN几乎对葡萄糖的氧化无催化作用，而MnO2和MnO2-OCN均呈现催化葡萄糖氧化的能力。研究表明[15]，MnO2本身是一种葡萄糖氧化的级联催化剂（如反应（1）和（2）所示），而OCN的引入进一步增强了MnO2的催化能力。因为OCN是一种具有优异的类过氧化物酶活性，但不具备类葡萄糖氧化酶活性的纳米酶，因此复合材料级联催化能力的显著提升可归因于对反应（2）的加速。这也说明了单体MnO2的类葡萄糖氧化酶活性较好，但类过氧化物酶活性较弱，不能充分利用反应（1）中生成的H2O2，而OCN的引入可以明显促进反应（2）中H2O2催化TMB氧化变色，使底物溶液的颜色加深。

    3.3?检测条件的优化

    反应条件对MnO2-OCN复合材料的级联类酶活性的影响显著，因此，对反应时间、反应温度、TMB浓度和pH值进行了优化。如图4所示，当溶液的pH=4.0时，底物溶液的吸收峰强度最大（图4A）。在20～60℃范围内，复合材料的催化活性在40℃时达到峰值（图4B）。由反应时间与吸收峰强度的关系可知，在反应10 min后，反应速度减慢（图4C），因此选择10 min作为催化显色的反应时间。综合考虑检测效果和试剂消耗，选择TMB的浓度为8 mmol/L（图4D）。

    3.4?葡萄糖检测

    基于MnO2-OCN复合材料的高催化活性，在优化的实验条件下测定葡萄糖。如图5A所示，葡萄糖浓度与650 nm处的吸光度在0.05～2.00 mmol/L范围内呈良好的线性关系（R2 = 0.9923），检出限（S/N=3）为23 μmol/L。根据米氏方程，计算得到MnO2-OCN催化氧化葡萄糖的米氏常数Km=0.21 mmol/L，表明此复合材料对葡萄糖有较高的亲和力。将本方法与文献报道的葡萄糖比色检测方法的分析性能进行比较（表1）可知，本方法的线性范围较宽，检出限较低。选择常见的共存物质果糖、乳糖、麦芽糖，考察反应的特异性，结果如图5B所示，10倍浓度的干扰物的响应信号远低于葡萄糖的响应信号，表明本方法对葡萄糖的检测具有高选择性。

    3.5?血清中葡萄糖的检测

    为了探究MnO2-OCN复合材料在实际生物样品中的适用性，采用本方法测试了人体血清中的葡萄糖浓度。血清中葡萄糖的标准加入实验结果如表2所示，加标回收率在91.9%～94.3%之间。在检测血清中葡萄糖时，此传感器表现出较高的精确性，可望用于实际样品中葡萄糖的检测。

    4?结 论

    采用简单方法制备了同时具有类过氧化物酶活性和类葡萄糖氧化酶活性的MnO2-OCN复合材料，构建了级联催化无酶比色葡萄糖传感器。将MnO2与OCN复合，利用OCN优异的类过氧化物酶活性，显著改善了对葡萄糖的催化性能。由于两种材料对底物催化的专一性，即MnO2选择性催化氧化葡萄糖，OCN选择性催化葡萄糖的氧化产物H2O2氧化TMB，此复合材料对于葡萄糖的检测具有较高的选择性。本研究为葡萄糖的无酶检测提供了一种简单有效的方法。

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