镰刀菌引起的西瓜猝倒病病原鉴定

    王芳 刘秀杰 刘继秀 高美玲

    

    

    

    摘? ? 要：为明确齐齐哈尔市郊区西瓜繁育基地西瓜幼苗猝倒的发病原因及为西瓜苗期病害防治提供依据，从发病区采集病样进行病原鉴定。结果分离获得12个菌株，根据培养特征和形态学特征，确定分离到的菌株为尖孢镰刀菌（Fusaruim oxysporum）;利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增菌株rDNA-ITS序列，GenBank数据库BLAST同源比对与F. oxysporum一致性达99%。将分离到的菌株回接到健康西瓜幼苗上，植株表现出与田间相似发病症状。基于形态学、分子生物学及致病性检测，最终确定齐齐哈尔市郊区育苗基地西瓜猝倒病的病原菌为Fusaruim oxysporum。

    关键词：西瓜猝倒病;镰刀菌;形态学特征;rDNA- ITS

    Abstract：Watermelon seedlings with damping off symptom was found in Qiqihar suburban breeding base. In order to identify the cause of disease， samples were collected from the diseased area. A total of 12 strains were isolated and identified as Fusaruim oxysporum according to the characteristics of culture and morphology. The sequence of rDNA-ITS was amplified using primers ITS1/ITS4， and BLAST homologous alignment in GenBank database was 99% consistent with that of F. oxysporum The isolated strains were inoculated to healthy watermelon seedlings and the plants showed symptoms similar to those in the field. Based on morphology， molecular biology and pathogenicity detection， Fusaruim oxysporum was identified as the pathogen of watermelon damping off in Qiqihar city suburban breeding base.

    Key words：Watermelon damping off; Fusaruim oxysporum; Morphological features; rDNA- ITS

    西瓜是人們夏季消热解暑的主要水果之一，在黑龙江省齐齐哈尔地区已有上百年的种植历史，市下辖的每个区、县几乎都有西瓜栽培，种植方式主要以育苗移栽为主。由于育苗期间苗床土壤低温、高湿，幼苗处于易感病阶段，利于病菌侵入，加之苗床管理不当，易发生病害。

    猝倒病是作物苗期的主要病害之一，可由多种土传病菌和种传病菌真菌侵染引起，如丝核菌属（Rhizoctonia）、镰刀菌属（Fusarium）、腐霉属（Pythium）、疫霉属（Phytophthora）等[1-5]。该病害也是西瓜苗期常见病害，但关于该病害的研究及报道相对较少。2012年，曾蓉等[6]从上海金山区的西瓜幼苗猝倒样本中分离到腐霉（Pythium spp.）。叶爱华[7-8]报道瓜果腐霉[Pythium aphanidermatum（Edson）Fitzp]和德里腐霉（Pythium deliense Meurs）均可引起西瓜猝倒，并也能引起大棚菠菜幼苗猝倒。

    2018年5月，黑龙江省齐齐哈尔市郊区西瓜繁育基地发现西瓜幼苗猝倒，发病率达30%。受害幼苗茎基部呈黄褐色水渍状病斑，后期倒伏、枯死，导致移栽苗数不够，西瓜成熟期不一致，影响生产。为明确西瓜猝倒病的病因，笔者对该地区西瓜幼苗猝倒病的分离纯化菌进行形态学和分子鉴定，以及致病性测定，旨在明确西瓜猝倒病病原菌的主要种类，为该病害的防治及抗病育种工作提供科学依据。

    1 材料与方法

    1.1 病株采集

    2018年5月，对黑龙江省齐齐哈尔市郊区西瓜繁育基地进行西瓜幼苗猝倒病发病症状的观察及取样，调查包括病斑颜色、大小、部位和发病率。

    1.2 病原菌分离与纯化

    参照方中达组织分离法进行病原菌分离[9]。将患病幼苗先用流水冲洗，在植株病健交界处剪取3～5 mm根段数块，然后用70%的乙醇表面消毒30 s，放入无菌水中连续清洗3次，接种到PDA平板上，25 ℃恒温培养。5 d后观察并记录分离物的类别和出现率。选取菌丝边缘接种到新的PDA平板上纯化培养，将纯化的菌株接种于PDA试管斜面培养基上4 ℃保存。

    1.3 病原菌形态学特征鉴定

    从纯化的病原菌培养基上，挑取菌丝边缘置于新的PDA培养基上，25 ℃恒温培养7 d，十字交叉法测量菌落生长直径，观察菌落形态、色素颜色、菌落生长速率及边缘生长情况。随机选大、小分生孢子各50个测量大小，显微镜下镜检大、小分生孢子、厚垣孢子及分生孢子梗的的形状及着生方式。根据BOOTH [10]分类系统进行形态学鉴定。

    1.4 病原菌分子生物学鉴定

    供试菌株接种在PDA 培养基上，25 ℃恒温培养7 d，取 0.2 g菌丝体，加入液氮研磨，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取病原菌基因组DNA。经1%凝胶电泳检测合格后，将其作为ITS区DNA扩增的模板。ITS区序列PCR扩增采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），预计分别扩增约540 bp。PCR反应体系为25 μL，包括：DNA模板1 μL，2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol·L ITS1 1 μL，10 μmol·L ITS 4 μL，dd H2O补至25 μL。扩增条件为：95 ℃预变性5 min，然后进行35个扩增循环即 95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增后的PCR产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

    1.5 病原菌致病性测定

    采用浸根法对代表分离菌株进行回接。先将西瓜种子用5%的NaClO溶液消毒10 min，55 ℃温汤浸种后，置25 ℃温箱催芽。待种子发芽并长到3～5 cm时将发芽种子移入小烧杯内，注入孢子悬浮液（浓度为1.0×106 个·mL），浸根时间为30 min，以清水作为对照。3次重复，每次重复5株。接种后，幼苗转入25～27 ℃温室培养。14 d后调查病害发生情况，并进行病原菌的重新分离及鉴定。

    2 结果与分析

    2.1 病害症状

    西瓜猝倒病发生在幼苗出土至真叶展开时期，发病率在30%左右。幼苗出土后，叶片仍保持绿色时就出现倒伏现象。取出病株可见茎基部或根部呈黄褐色水渍状病斑，后期茎基部呈缢缩（图1）。

    2.2 病原菌形态鉴定

    观察PDA平板正面，菌落呈白色，菌丝生长茂盛、密集，平均每天生长0.8 cm，气生菌丝绒毛状;培养基背面呈橙黄色，基物无色。小型分生孢子较多，椭圆形或肾形，0～2个隔膜，假头状着生在产孢细胞上，大小为（3.8～11.1） μm×（1.0～3.0） μm;大型分生孢子镰刀形或纺锤形，3～4个隔膜居多，大小为（12.5～37.0） μm×（2.3～5.0） μm;厚垣孢子球形，单生或串生（图2）。这些形态特征与Booth的镰刀菌分类系统中尖孢镰刀菌的形态特征基本一致，初步将具有这些形态特征的分离物鉴定为尖孢镰刀菌（Fusaruim oxysporum）。

    2.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

    提取代表菌株XG1-1基因组DNA，利用真菌通用引物ITS1/ ITS4 PCR扩增rDNA-ITS序列，扩增序列片段大小分别为541 bp。在GenBank数据库中序列进行BLAST比对分析，代表菌株XG1-1的ITS序列與尖孢镰刀菌（F. oxysporum）的相似性达99%（Genbank 登录号JF807397）。根据供试菌株形态学特征及rDNA-ITS序列分析结果，将该菌株鉴定为尖孢镰刀菌。

    2.4 病原菌致病性测定

    采用浸根法将分离物接种到西瓜幼苗根部。接种14 d后，发现幼苗子叶完好，但近地面处的茎基部或根茎部呈现出黄色至黄褐色水渍状缢缩病斑，大多数幼苗呈现倒伏现象，与田间发病症状一致。取病健交界组织，进行病原菌分离，得到分离物与接种菌株形态相同，证明所接菌株为西瓜猝倒病的病原菌。

    3 讨论与结论

    猝倒病是西瓜苗期常见病害之一，而病原学研究是防治病害的基础，关于其病原鉴定的报道相对较少。已报道的病原菌有瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）和德里腐霉（Pythium deliense）。笔者从齐齐哈尔市郊区西瓜繁育基地的西瓜幼苗中分离到致病菌尖孢镰刀菌F. oxysporum，致病性测定表明这种镰刀菌也可侵染甜瓜幼苗。

    尖孢镰刀菌是一种土壤习居菌，既可以单独侵染植物，也可以与其他镰刀菌或其他病原菌共同作用混合侵染植物。该病原菌寄主范围广，可侵染松苗及棉花苗使幼苗猝倒;可危害成株期的西瓜及烟草、白菜、玉米等多种作物致使根腐或枯萎[11-15]。以往研究中，镰刀菌属病原菌的分类主要依据形态特征划分，但分子生物技术及生物信息学的发展为一些形态相近的姊妹种和复合种的准确区分提供了可能，如 F. oxysporum Schlecht. ex Snyder et Hansen、F. solani （Martius） Appel et Wollenw. ex Snyder et Hansen、F. graminearum Schwabe等已被区分[16]。笔者利用形态学及DNA序列分析技术，并结合致病性检测，明确引起齐齐哈尔市西瓜育种基地幼苗猝倒病病原菌为尖孢镰刀菌，为西瓜苗期病害防控提供了理论依据。

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