基于石墨烯增敏的甲基对硫磷分子印迹电化学传感器的研制

    吴佳雯 谢周鉴 谭学才 胡琪 雷福厚

    

    

    

    摘?要?以甲基对硫磷为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，马来松香丙烯酸乙二醇酯为交联剂，在石墨烯修饰的玻碳电极表面合成分子印迹聚合物膜，制备分子印迹电化学传感器，用于检测有机磷农药甲基对硫磷。采用循环伏安法、微分脉冲伏安法、电化学交流阻抗法研究传感器的电化学特性及分析特性。结果表明，在最佳检测条件下，传感器的峰电流与甲基对硫磷浓度在1.0×10?7～8.0×10?5 mol/L范围内呈线性关系，线性方程为Ip （μA）=0.65199-0.02387C （μmol/L），相关系数R2为0.9922，检出限为5.0×10?8 mol/L（S/N=3）。构建了传感器的动力学吸附模型，测得印迹传感器的结合速率常数k=20.2758s。将此传感器用于番茄样品中甲基对硫磷的检测，加标回收率为95.0%～100.3%。

    关键词?甲基对硫磷;石墨烯;分子印迹电化学传感器;马来松香丙烯酸乙二醇酯

    1?引 言

    甲基对硫磷（Methyl parathion，MP）是一种高毒致命的神经毒剂[1，2]，因其防治虫害高效快速，被广泛应用于农业生产中[3，4]。MP较难降解，在环境中残留期较长，对人体和环境安全存在危害[5]，如不慎被人或动物摄入，即使是低剂量，也会对其视觉系统、感觉功能和认知能力造成严重损害[6]。因此，建立准确灵敏的MP检测方法具有重要意义。

    目前，检测MP的方法主要有气相色谱法（GC）[7，8]、高效液相色谱法（HPLC）[9]、氣相色谱-质谱法（GC-MS）[10，11]、液相色谱-质谱法（LC-MS）[12，13]、荧光传感器法[4，5]、紫外分光光度法[14]、表面增强拉曼光谱法[15]和结合纳米材料制备的电化学传感器法[1～3]等。传统的色谱法虽可准确灵敏地检测MP，但所用仪器精密昂贵，检测耗时，过程繁琐复杂，且必须由专业技术人员进行操作;荧光传感器易受环境因素干扰;紫外分光光度法易受光（电）源影响而产生较大误差;表面增强拉曼光谱法需要制备高稳定性高拉曼增强活性的基底材料。因此，有必要建立一种稳定性高、制备简单、成本低廉的MP检测方法。

    电化学方法具有灵敏度高，响应速度快等特点，在检测农药、金属离子、污染物等领域应用广泛[16]。分子印迹电化学传感器是建立在分子印迹聚合物的基础上，将电化学方法与分子印迹技术相结合的传感器。在共聚的过程中，模板分子与聚合物单体通过多重作用点聚合;去除模板分子后，聚合物中形成对模板分子具有特异性识别位点的空穴，这种空穴使得聚合物对模板分子具有特异性识别功能[17]。分子印迹电化学传感器具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优点[18～22]。然而，分子印迹聚合物膜通常存在附着力差、电化学信号低等不足。纳米材料具有特殊的理化性质和较大的比表面积，可提高电子传递速率，放大电化学信号，结合纳米材料制备分子印迹电化学传感器可以很好地弥补分子印迹聚合物膜存在的不足[23，24]。石墨烯（Graphene，GR）是一种二维结构的碳纳米材料，具有良好的导电性和稳定性，在制备电化学传感器方面发展潜力巨大。利用石墨烯制备电化学传感器检测各类物质也是近年的研究热点，如采用石墨烯制备电化学传感器检测抗坏血酸、多巴胺和尿酸[25]，采用石墨烯和单壁碳纳米管复合材料制备印迹溶胶-凝胶电化学传感器检测没食子酸丙酯[26]等。此外，结合石墨烯制备分子印迹电化学传感器检测甲基对硫磷也有相关文献报道，如采用氮掺杂石墨烯制备分子印迹传感器检测甲基对硫磷[27]、采用离子液体-石墨烯复合材料制备分子印迹聚合物检测甲基对硫磷[28]等。

    本研究以有机磷农药MP为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，自合成的马来松香丙烯酸乙二醇酯为交联剂，结合纳米材料石墨烯制备了一种分子印迹电化学传感器，并用于检测MP。在分子印迹聚合物膜的制备过程中，交联剂起固定聚合物空间骨架的作用。本研究采用的交联剂马来松香丙烯酸乙二醇酯由广西特色资源松香改性制得，以其作为交联剂具有机械性能良好、交联度高和用量少等优点[29，30]。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    PGSTAT128N电化学工作站（瑞士万通公司）;DZF-6020真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）;采用三电极系统，玻碳电极GCE（φ=3.0 mm）为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极（φ=1.0 mm）为对电极。

    甲基对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、三唑磷（分析标准品，阿拉丁试剂有限公司）;伏杀磷（分析标准品，美国Accustandard公司）;单层石墨烯粉末（南京先丰纳米材料科技有限公司）;甲基丙烯酸（分析纯，阿拉丁试剂有限公司）;马来松香丙烯酸乙二醇酯（自制[31]）。其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

    2.2?石墨烯修饰电极的制备

    将玻碳电极用0.05 μm Al2O3粉末抛光，然后依次用HNO3（1∶1，V/V）、无水乙醇和超纯水超声清洗5 min，待用。称取5 mg 单层石墨烯粉末于小烧杯中，加入5 mL四氢呋喃，超声30 min，使其充分混匀，制得石墨烯分散液（1 mg/mL）。取2 μL混匀的石墨烯分散液，滴涂在玻碳电极表面，将电极置于真空干燥箱（60℃）中1 h，使溶剂彻底挥发，制得石墨烯修饰电极（GR/GCE）。

    2.3?印迹及非印迹电极的制备

    取2 mL甲苯于小烧杯中，依次加入模板分子MP（0.1 mmol）、功能单体甲基丙烯酸（0.4 mmol）、交联剂马来松香丙烯酸乙二醇酯（0.4 mmol）和引发剂偶氮二异丁腈（0.0160 g），超声使其混合均匀。将2 μL混合液滴涂到石墨烯修饰电极表面，静置90 s，使混合液均匀成膜;将电极置于真空干燥箱（60℃）内热聚合5 h，制得未洗脱MP分子的印迹电极（nMIP/GR/GCE），将nMIP/GR/GCE置于乙酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液中60 s，洗脱MP分子，制得洗脱MP分子后的印迹电极（MIP/GR/GCE）;非印迹电极（NIP/GR/GCE）的制备，除不加模板分子MP外，其余步骤相同。

    2.4?实际样品的检测

    番茄样品进行粉碎处理，准确称取5.0 g番茄样品，依次加入10 mL水、15 mL乙醇，摇晃使其完全混合均匀，离心6 min，取上清液，用柠檬酸-柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L，pH=7.0）定容至100 mL，制得番茄样品溶液，采用本方法进行检测，并进行加标回收实验。

    3?结果与讨论

    3.1?分子印迹膜的制备流程

    MP分子印迹聚合物的制备过程如图1所示。首先，MP和功能單体甲基丙烯酸通过氢键结合形成加合物;再加入交联剂马来松香丙烯酸乙二醇酯和引发剂偶氮二异丁腈，使MP和甲基丙烯酸聚合成交联度较高的分子印迹聚合物;最后，用合适的方法去除MP，聚合物膜内仅留下与MP结构互补的“空穴”。

    3.2?分子印迹膜的电化学表征

    采用循环伏安法对分子印迹膜进行电化学表征。如图2所示，GR/GCE （a）上的循环伏安电流响应大于裸电极GCE（b）上的电流响应，说明裸电极表面修饰石墨烯后，电子传递速率提高，因此电化学信号增大，体现了石墨烯良好的增敏作用;nMIP/GR/GCE（e）和NIP/GR/GCE（f）上几乎没有电化学响应，这是因为电极表面被一层致密且导电性差的分子印迹聚合物膜覆盖，使得电子传递严重受阻;MIP/GR/GCE（c）上有一定的电流响应，这是因为洗脱了MP分子后，聚合物膜中留下了大量与MP空间结构互补的“空穴”，电子可通过这些“空穴”进行传递，从而产生电流响应。将MIP/GR/GCE（c）在4.5× 10?6 mol/L MP溶液中进行孵育，在孵育后的MIP/GR/GCE（d）上的电流响应减小，说明MP分子重新吸附到聚合物膜中，填补了聚合物膜中的“空穴”。

    采用电化学交流阻抗法考察电极表面的变化。图3是不同电极的电化学交流阻抗图，内插图是等效电路图，其中，Rs是电解质电阻，Cdl是电极表面的双电层电容，Ret是电极表面的电子传递电阻。交流阻抗图中高频部分测得的半圆直径大小对应于Ret的数值。对不同电极的交流阻抗图进行数据分析，得到不同电极的Ret值：GR/GCE（a，3.39×102 Ω）、GCE（b，4.55×102 Ω）、MIP/GR/GCE（c，4.99×103 Ω）、孵育后的MIP/GR/GCE（d，6.54×103 Ω）、nMIP/GR/GCE（e，1.37×104Ω）、NIP/GR/GCE（f，1.11×104Ω）。GR/GCE表面的Ret值小于GCE，说明电极表面修饰石墨烯后，减小了电子传递阻力，更易进行电子传递;nMIP/GR/GCE和NIP/GR/GCE因表面被致密的聚合物膜覆盖，电子传递阻力很大，因此Ret值相对较大;洗脱了MP分子后，电极的Ret值较洗脱前减小，说明印迹聚合物膜中留有大量印迹“空穴”，电子传递阻碍减小;孵育后的MIP/GR/GCE由于重新吸附了MP分子，减弱了电子传递速率，因此Ret值较孵育前增大。

    3.3?实验条件的优化

    影响分子印迹电化学传感器分析性能的主要因素有洗脱溶剂和时间、支持电解质、孵育时间等，因此，有必要对上述实验条件进行优化。

    3.3.1?洗脱溶剂和时间的影响?甲醇的极性较大且浸透性好，作为模板洗脱溶剂，洗脱效率高于二氯甲烷和乙腈。在甲醇中添加适量乙酸可增加溶剂的洗脱作用力，破坏模板与聚合物之间的结合力，有效减少模板分子的渗漏，且乙酸-甲醇均溶于水，洗脱后用超纯水冲洗电极可以很好地去除残留在电极上的洗脱剂，因此，选择乙酸-甲醇作为洗脱溶剂。洗脱溶剂的酸性过强，可能会破坏聚合物膜的空间结构，影响对MP的识别效果，分别考察了乙酸-甲醇（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6，V/V）对MP的洗脱效果，结果表明，乙酸-甲醇（1∶9，V/V）中MP的洗脱效果最佳。将印迹电极置于乙酸-甲醇（1∶9，V/V）中洗脱MP，利用K3[Fe（CN）6]作电化学探针，进行微分脉冲伏安（DPV）扫描。如图4所示，随着洗脱时间延长，MP逐渐溶出，电极表面的“空穴”增多，DPV峰电流随之增加，当洗脱时间大于60 s后，峰电流趋于稳定，说明60 s后MP已经洗脱完全，因此，选择60 s作为最佳的洗脱时间。

    3.3.2?支持电解质的选择?采用DPV法，考察了MIP/GR/GCE在柠檬酸-柠檬酸钠、KCl、NH3·H2O-NH4Cl、HAc-NaAc、KH2PO4-K2HPO4（0.1 mol/L，pH=7.0）等电解质溶液中的电化学响应。结果表明，在0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠溶液中，峰电流最大且峰形最佳。

    考察了不同pH值（4.0～7.5）的柠檬酸-柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L）对K3[Fe（CN）6]?DPV峰电流的影响。如图5所示，当支持电解质的pH=7.0时，电流响应最大，因此，选择柠檬酸-柠檬酸钠溶液（0.1 mol/L，pH=7.0）作为最佳支持电解质。

    3.3.3?孵育时间的选择?采用DPV法，考察了MIP/GR/GCE在4.5×10?6 mol/L MP溶液中孵育时间（0～150 s）对峰电流的影响。如图6所示，在0～120 s，峰电流随着孵育时间的延长而减小，孵育时间大于120 s后，电流响应趋于稳定，说明此时 MIP/GR/GCE结合MP分子已达饱和。因此，选择孵育时间为120 s。

    3.4?分子印迹膜传感器的电化学响应特征

    3.4.1?线性范围和检出限?在最佳实验条件下，采用DPV法考察了MIP/GR/GCE在不同浓度的MP溶液中的电化学响应。如图7所示，传感器的还原峰电流与MP的浓度在1.0 × 10?7～8.0 × 10?5 mol/L范围内线性关系良好，线性方程为Ip（μA）=?0.65199-0.02387C （μmol/L），相关系数R2=0.9922，检出限为5.0 × 10?8 mol/L （S/N=3），低于国家标准（GB 23200.8-2016）[32]对甲基对硫磷的限量水平（1.65 × 10?7 mol/L）。与文献报道的方法相比，本方法具有较宽的线性范围和较低的检出限（表1）。

    3.4.2?分子印迹膜传感器的选择性

    采用DPV法考察了MIP/GR/GCE的选择性。选择MP的结构类似物（毒死蜱、三唑磷、辛硫磷、伏杀磷）进行测试。将MIP/GR/GCE分别置于MP、毒死蜱、三唑磷、辛硫磷、伏杀磷溶液中进行DPV扫描，MP溶液浓度为4.5×10?6 mol/L，结构类似物溶液浓度均0.6-0.1 V 5mol/L。 如图8所示，MP的电流响应明显大于结构类似物，毒死蜱、三唑磷、辛硫磷、伏杀磷的电流响應分别相当于MP电流响应的24.7%、20.1%、21.0%和18.8%。传感器对MP电流响应较大是因为MIP/GR/GCE和MP发生特异性结合，而与结构类似物主要是非特异性结合，因此，测得的电流响应较小，表明所研制的传感器对MP具有较高的选择性。

    3.4.3?分子印迹膜传感器动力学研究

    图9是MIP/GR/GCE和NIP/GR/GCE在4.5×10?6 mol/L MP溶液中吸附时间对传感器峰电流变化值ΔIp的影响图，利用Langmuir吸附模型，拟合上述两种传感器吸附MP的动力学曲线：

    其中，t为吸附时间;ΔIp为t时刻传感器吸附溶液中物质的响应电流变化值;ΔIpm为吸附平衡时的响应电流变化值;k为动力学结合速率常数。

    拟合参数见表2，MIP/GR/GCE的ΔIpm明显大于NIP/GR/GCE，表明MIP/GR/GCE对MP的再结合量大于NIP/GR/GCE，这是由于MIP/GR/GCE内存在可与MP结合的识别位点，而NIP/GR/GCE内的结合位点较少，因而吸附量较小。

    3.4.4?重现性和稳定性?在最佳的实验条件下，6 mol/L MP溶液中平行测定11次，RSD为2.7%;将5根相同条件下制备的MIP/GR/GCE置于4.5 × 10?6 mol/L MP溶液中进行检测，RSD为3.4%，表明所制备的传感器具有较好的重现性。将MIP/GR/GCE保存7天后，测得的电流响应值是初始响应的94.8%，说明传感器稳定性较好。

    3.5?实际样品分析

    在最佳实验条件下，采用本方法对番茄样品检测，番茄样品中未检出MP，加标回收实验结果见表3，回收率在95.0%～100.3%范围内，RSD为1.9%～2.3%。因此，本方法可用于番茄样品中甲基对硫磷的检测。

    4?结 论

    研制了一种石墨烯增敏的分子印迹电化学传感器，用于检测有机磷农药MP。在分子印迹传感器的制备中结合纳米材料石墨烯，有效提高了传感器的分析性能。此传感器检测快速、成本低廉且选择性高，并成功应用于番茄样品中MP的检测，可作为一种新型的分子印迹电化学传感器用于检测实际样品中的MP。

    References

    1?Wang Z P，Ma B K，Shen C，Cheong L Z. Talanta，2019，197： 356-362

    2?Gannavarapu K P，Ganesh V，Thakkar M，Mitra S，Dandamudi R B. Sens. Actuator B.，2019，288： 611-617

    3?Zhou H H，Wei C H N，Fang J，Fu L K，Liu G，Liu Q M. J. Electroanal. Chem.，2019，848： 113282

    4?Song W，Zhang H J，Liu Y H，Ren C L，Chen H L. Chinese Chem. Lett.，2017，28（8）： 1675-1680

    5?Zhang F M，Liu Y B，Ma P Y，Tao S，Sun Y，Wang X H，Song D Q. Talanta，2019，204： 13-19

    6?Gao X Y，Gao Y，Bian C C，Ma H Y，Liu H L. Electrochim. Acta，2019，310： 78-85

    7?Zhang Y P，Yang J，Shi R H，Su Q D，Gao Y，Zhu X L. Chromatographia，2011，73： 385-391

    8?Zhao X S，Kong W J，Wei J H，Yang M H. Food Chem.，2014，162： 270-276

    9?Seebunrueng K，Santaladchaiyakit Y，Soisungnoen P，Srijaranai S. Anal. Bioanal. Chem.，2011，401： 1703-1712

    10?Silva D F D，Silva F E P，Silva F G S，Nunes G S，Badea M. Pest. Manag. Sci.，2015，71 （11） ： 1497-1502

    11?Cacho J I，Campillo N，Vinas P，Hernandez-Cordoba M. J. Chromatogr. A，2018，1559： 95-101

    12?Masia A，Suarez-Varela M M，Llopis-Gonzalez A，Pico Y. Anal. Chim. Acta，2016，936： 40-61

    13?Armstrong J L，Dills R L，Yu J B，Yost M G，Fenske R A. J. Environ. Sci. Heal. B，2013，49（2）： 102-108

    14?Tiwari N，Asthana A，Upadhyay K. Spectrochim. Acta A，2013，101： 54-58

    15?Xie J，Li L Y，Khan I M，Wang Z P，Ma X Y. Spectrochim. Acta A，2020，231： 118104

    16?Zhao M G，Qu H Y，Shang J H，Li H，Zhuang Y P，He Y，Zhang Y，Chen S G. Sens. Actuators B，2019，285： 413-417

    17?Bai H P，Wang C Q，Chen J，Li Z X，Fu K X，Cao Q. J. Electroanal. Chem.，2018，816： 7-13

    18?Karthik R，Kumar J V，Chen S M，Kokulnathan T，Chen T W，Sakthinathan S，Chiu T W，Muthuraj V. Sens. Actuators B，2018，270： 353-361

    19?Pan M F，Fang G Z，Lu Y，Kong L J，Yang Y K，Wang S. Sens. Actuators B，2015，207： 588-595

    20?Florea A，Guo Z Z，Cristea C，Bessueille F，Vocanson F，Goutaland F，Dzyadevych S，Sandulescu R，Jaffrezic-Renault N. Talanta，2015，138： 71-76

    21?Nezhadali A，Mojarrab M. J. Electroanal. Chem.，2015，744： 85-94

    22?Liu Y，Liu J，Tang H，Liu J，Xu B B，Yu F，Li Y C. Sens. Actuators B，2015，206： 647-652

    23?Tan X C，Hu Q，Wu J W，Li X Y，Li P F，Yu H C，Li X Y，Lei F H. Sens. Actuators B，2015，220： 216-221

    24?Ghanei-Motlagh M，Taher M A，Heydari A，Ghanei-Motlagh R，Gupta V K. Mat. Sci. Eng. C，2016，63： 367-375

    25?Qi S P，Zhao B，Tang H Q，Jiang X Q. Electrochim. Acta，2015，161： 395-402

    26?Xu G L，Chi Y，Li L，Liu S H，Kan X W. Food Chem.，2015，177： 37-42

    27?Xue X D，Wei Q，Wu D，Li H，Zhang Y，Feng R，Du B. Electrochim. Acta，2014，116： 366-371

    28?Zhao L J，Zhao F Q，Zeng B Z. Sens. Actuators B，2013，176： 818-824

    29?TAN Xue-Cai，WU Jia-Wen，HU Qi，LI Xiao-Yu，LI Peng-Fei，YU Hui-Cheng，LI Xiao-Yan，LEI Fu-Hou. Chinese J. Anal. Chem.，2015，43（3）： 387-393

    譚学才，吴佳雯，胡 琪，李晓宇，李鹏飞，余会成，李小燕，雷福厚. 分析化学，2015，43（3）： 387-393

    30?Tan X C，Wu J W，Hu Q，Li X Y，Li P F，Yu H C，Li X Y，Lei F H. Anal. Methods，2015，7（11）： 4786-4792

    31?LEI Fu-Hou，ZHAO Kang，LI Xiao-Yan，LU Jian-Fang，GUAN Yu-Ting. Fine Chem.，2010，27（1）： 11-15

    雷福厚，赵 慷，李小燕，卢建芳，关瑜婷. 精细化工，2010，27（1）： 11-15

    32?GB 23200.8-2016，Determination of 500 Pesticides and Related Chemicals Residues in Fruits and Vegetables. National Standards of the People's Republic of China

    水果和蔬菜中500种农药及相关化学品残留量的测定. 中华人民共和国国家标准. GB 23200.8-2016

    33?LI Jun，ZHU Feng-Mei，DU Bin. J. Chin. Inst. Food Sci. Tech.，2010，10（1）： 186-189

    李 军，朱凤妹，杜 彬. 中国食品学报，2010，10（1）： 186-189

    34?XU Jin-Sheng，DENG Jian，KUANG Yun-Fei. Chinese J. Anal. Lab.，2011，30（9）： 66-70

    许金生，邓 健，匡云飞. 分析试验室，2011，30（9）： 66-70

    35?LI Yue-Qiu，DU Guang-Lin，LI Jun，ZHAO Yan-Yan，HAN Yuan-Yuan，LIU Li-Yan. ?Food Res. Dev.，2014，35（10）： 82-85

    李月秋，杜光玲，李 军，赵燕燕，韩媛媛，刘丽艳. 食品研究与开发，2014，35（10）： 82-85