等离子体对玉米优势腐败菌黄曲霉灭活作用的研究
李帅 曾英男
摘 要：以玉米优势腐败菌黄曲霉为试验对象，采用低温等离子体技术对污染黄曲霉菌的玉米籽粒进行处理，研究不同等离子体处理功率、处理时间和真空度对黄曲霉杀菌效果的影响。结果表明，杀菌最佳工艺为：等离子体处理功率447W、等离子体处理时间160s、真空度80Pa;在此條件下，等离子体对黄曲霉的杀菌率为85.42%。
关键词：黄曲霉;等离子体;杀菌
中图分类号 TS201.3文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）07-0098-04
Study on the Inactivation of Aspergillus flavus by Low-temperature Plasma
LI Shuai et al.
（Jilin Agricultural Science and Technology University， Jilin 132101， China）
Abstract： In this paper， the dominant corn spoilage bacteria Aspergillus flavus was used as the research object. The plasma technology was used to treat corn kernels contaminated with Aspergillus flavus. The effect of different plasma treatment power， treatment time and vacuum degree on the sterilization effect of the target bacteria was studied. The best process for sterilization was determined by surface experiments： the plasma treatment power was 447 W， the plasma treatment time was 160 s， the vacuum degree was 80 Pa， and the sterilization rate of Aspergillus flavus was 85.42%. Scanning electron microscopy results showed that the spores of Aspergillus flavus were destroyed and the mold spores died after plasma treatment.
Key words： Aspergillus flavus; Plasma; Sterilization
玉米作为我国主要的粮食作物之一，是食品工业原料的主要来源[1，2]。新收获的玉米的含水率较高，若不及时进行干燥，在贮藏和运输过程中易发霉变质，严重影响玉米的品质[3-5]。储粮真菌危害是全球长期以来共同面临的一个安全问题。玉米在储藏期间，外界温湿度的变化易滋生黄曲霉菌[6，7]，其产生的次级代谢物黄曲霉毒素具有强烈的致癌性，不仅降低了玉米的品质，造成一定的经济损失，而且对人畜的生命安全产生威胁[8-10]。
等离子体是由离子、电子、自由基以及中性粒子组成的一种准中性气体[11，12]，被称为除固、液、气之外物质的“第四态”[13，14]。等离子体技术具有工作效率高、环保和适用性强等优点，在材料科学、食品工业和生物医学等领域得到了广泛应用[15]。Dasan[16]等采用流化床低温等离子体对已感染黄曲霉的玉米籽粒进行处理，结果表明，等离子体处理5min后，黄曲霉最高减少5.48lg（CFU/g），将经过等离子体处理的玉米样品25℃下储存30d后黄曲霉孢子没有继续生长。Mitra[17]等采用大气压低温等离子体处理鹰嘴豆种子，处理5min后天然微生物群菌落总数减少2lg（CFU/g）。说明等离子体离子体技术可应用于杀死种子表面致腐微生物。
本研究选取黄曲霉为对象，采用平板计数法，考察经等离子体处理后玉米霉菌生长量的变化规律，探讨等离子体处理对黄曲霉杀菌效果的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 试验材料：玉米籽粒（先玉335）;黄曲霉（H4-5），为吉林大学生物与农业工程学院微生物实验室保存菌株。试验仪器：SY-DT02S型低温等离子体处理仪（苏州奥普斯等离子体科技有限公司）;JA3003A型电子精密天平（上海精天电子仪器有限公司）;SJ-CJ-1F洁净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）;BSP-150生化培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。
1.2 试验方法
1.2.1 孢子菌悬液的制备 将黄曲霉孢子接种在察氏培养基上，28℃培养3～7d，用灭菌后pH为7.2的磷酸盐缓冲液（含0.05%吐温-80）冲洗，过滤除去菌丝残体，吸取50?L于血球计数板计数格上，用盖玻片压除多余菌液和气泡，调制浓度107～108CFU/mL，摇匀，备用[18]。
1.2.2 杀菌效果检测 分析各因素对等离子体杀菌效果的影响，杀菌率根据公式（1）计算。
[Y（%）=N0-NN0×100] （1）
式中：N0为等离子体处理前黄曲霉菌落数;N为等离子体黄曲霉菌落数;Y为杀菌率，%。
1.2.3 单因素试验设计 根据参考文献[19]方法结合预试验，本章主要考察等离子体预处理时间（60、90、120、150、180s）;等离子体预处理功率（100、200、300、400、500W）;真空度（75、80、85、90、95Pa）对玉米籽粒黄曲霉杀菌效果的影响。当对其中一个因素进行研究时，其余各因素分别固定为：等离子体预处理时间120s，等离处理功率300W，真空度85Pa。
1.2.4 响应面试验设计 选取等离子体处理时间、功率和真空度3个因素进行响应面试验，因素与水平设计见表1。
1.3 数据统计与分析 本试验利用Design-Expert V 8.0.6.1、SPSS 17.0、Origin 7.5等軟件进行数据处理，以P<0.05的Duncan法进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 处理时间对杀菌率的影响 由图1可知，黄曲霉杀菌率随处理时间的增加而增大。处理时间60s时，杀菌率仅为39.54%，而在处理时间为180s时，杀菌率达80.15%。这是由于在高压电场条件下，介质气体处于高度电离状态，产生的活性基团和粒子破坏了菌体的细胞结构和蛋白质，导致微生物的死亡[18]。随着等离子体处理时间的延长，活性基团和粒子也随之增多，使得杀菌率增加。
2.2 处理功率对杀菌率的影响 由图2可知，随着等离子体处理功率的增加，杀菌率随之增大。当等离子体处理功率为100W时，杀菌率仅为22.78%，而在处理功率达500W时，杀菌率达88.42%。产生这种现象的原因是随着等离子处理功率的增大，高能粒子能量的增加，粒子流量密度和活性基团数量也随之增加，因此杀菌率增大。
2.3 真空度对杀菌率的影响 由图3可知，杀菌率随真空度的增大而减小。当真空度为75Pa时，杀菌率为76.92%，而当真空度为95Pa时，杀菌率为60.78%。这是由于当真空度较低时，放电完全，产生等离子体密度较高，霉菌与等离子体产生的活性粒子发生强烈的碰撞，且微生物细胞的表面病变不能及时快速修复，最终导致微生物灭活，杀菌效果好[17]。
2.4 响应面优化试验结果
2.4.1 回归模型的建立及方差分析 对表2中数据进行多元回归拟合，得到回归方程如下：
Y=84.66+5.04X1+4.18X2-0.49X3+5.86X1X2+1.29X1X3-1.02X2X3-7.49X12-10.06X22-3.06X32，公式中X1为等离子体处理功率，W;X2为等离子体处理时间，s;X3为真空度，Pa。
由表3可知，模型差异极显著（P<0.01）;失拟不显著（P=0.059<0.05）。模型与实际拟合程度较好（R2=0.9265）。
回归方程各显著项表明，一次项X1（P<0.05）影响极显著，X2（P<0.01）影响显著，因此对杀菌率影响最大的是等离子体处理功率，然后是等离子体处理时间，最后是真空度，即X1<x2<x3。二次项x12和x22影响均极显著。x1x2交互项作用显著。
2.4.2 等高线分析 由图4可知，等离子体处理功率和处理时间两者的交互作用最显著，处理功率和真空度两者的交互作用次之，处理时间和真空度的交互作用最小。
3 结论
通过单因素试验和Box-Behnken响应面法试验，以杀菌率为响应值，得到等离子体处理功率为447W、等离子体处理时间为160.5s、真空度为80.2Pa，预测得出杀菌率为89.57%。根据实际工作条件，将最佳工艺调整为：等离子体处理功率447W、等离子体处理时间160s、真空度80Pa，在此条件下，黄曲霉杀菌率为89.42%。
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（责编：张宏民）
