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利用紫外线辐射技术修复抗性基因污染土壤

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吴丛杨慧高连东

摘要：针对来自医疗废物堆放场地的抗性基因污染土壤，本研究利用紫外线辐射技术进行土壤修复。其间通过试验研究了紫外波长与照射时间、土壤中碳酸钙含量对土壤中关注类抗性基因氨基糖苷类（aminoglycosides）、氯霉素类（chloramphenicol）、磺胺类（sulfonamides）、四环素类（tetracycline）的降解影响。结果表明，在254 nm紫外波长的照射下，向土壤添加5%的石灰，设置1 min的紫外照射时间，更有利于上述四种抗性基因的降解，可有效修复该污染土壤。

关键词：土壤修复;抗生素抗性基因;高通量测序;降解

中图分类号：TU991.25文献标识码：A文章编号：1003-5168（2020）35-0137-04

Abstract： In this study， ultraviolet radiation technology was used to dispose the soil samples from the medical waste dump site. During the experiment， the effects of ultraviolet wavelength， irradiation time， and calcium carbonate content in the soil on the degradation of resistance genes of concern namely aminoglycosides， chloramphenicol， sulfonamides， and tetracycline in the soil were studied. The results showed that 5% content of calcium carbonate was added to soil and UV irradiation time was set for 1 min at 254 nm， which was more conducive to the degradation of the concerned ARGs and was effective for soil remediation.

Keywords： soil remediation;antibiotic resistance genes;high-throughput sequencing;degradation

在全球范围内，抗生素滥用情况严重，加速了抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）在细菌间的传播，并产生细菌的耐药性，增加致死率和治病率[1]。ARGs通常位于质粒、转座子等可动遗传因子（Mobilegeneticelement）上，由于基因水平转移（Horizontal Gene Transfer，HGT）作用[2]，致病菌也可从环境非病原性微生物中获得ARGs，因此，ARGs不仅在微生物细胞中能够长久而持续地传播，同时细菌也可以通过摄取游离DNA获取ARGs[3]。目前已有大量研究表明，ARGs在水体和底泥等生态环境中广泛存在[4]，同时土壤也是ARGs的库源[5]。近些年来，土壤中ARGs及其带来的抗生素抗性污染受到日益广泛的关注，但对土壤中的抗性基因处置方式报道较少，而利用紫外消毒技术处理废水中的ARGs常见于报道[6-7]。

医疗废物中常含有病原微生物等有害物质，如果处置不当，使其进入土壤中，可能破坏土壤微生态，并导致土壤菌群结构发生改变。针对某医疗固废堆放场的污染土壤，本文利用紫外线辐射技术并采用定制的紫外设备，对该抗生素污染土壤进行修复处理，探寻针对该土壤的最佳修复模式。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

本试验土壤采集自苏州某医疗废弃物堆置场地的抗性基因污染区域土壤，该场地内原从事医疗废物的非法处置活动，非法堆放有一次性使用后的输液玻璃瓶、塑料袋、注射器（针）以及输液器（针）等医疗废弃用品。根据前期场地环境调查，该堆置范围的土壤氨基糖苷类、氯霉素类、磺胺类和四环素类等常用抗生素药物对应ARGs的丰度和多样性显著高于土壤背景值[8]。土壤理化性质如表1所示。

土壤在现场采集后装入密封袋，然后装入含有蓝冰的灭菌保温箱，运回实验室在4 ℃冷藏室保存。土壤基本理化性质如表1所示。

1.2 试验方法

在不同的土壤样品中分别加入不同浓度的碳酸钙，混合均匀后分别采用220 nm和254 nm波长的紫外設备照射土壤样品。试验共设计1%和5%两种浓度的碳酸钙，选用220 nm和254 nm两种紫外线波长，紫外照射时间选择1 min和2 min两种时间进行处理，以不添加碳酸钙和未经紫外照射的样品为对照值。

1.2.1 土壤样品的处理及制备。直接采用手工筛选方式，去除土壤样品中的大石块、植物根系与垃圾等，并将所有土壤人工破碎，混合均匀，过10目筛，将无法通过的大颗粒默认为无污染或轻污染土壤，然后去除。每份土壤取3.0 kg，向不同土壤中分别添加1%、5%的碳酸钙（分析纯），混合均匀。

1.2.2 紫外设备对土壤样品的处理。本次试验的紫外设备为非标定制产品，具体结构为装有紫外灯管的密闭灯盒。盒体由不锈钢构成，呈长方体，盒体尺寸40 cm×80 cm×20 cm。盒部顶端装有3根可更换不同波长的紫外灯管，盒部两端由可移动木块密封盒体，便于底部土壤取出。试验时，在不锈钢密闭盒底部放置一层牛皮不锈纸，其上将专用塑料刮板摊铺均匀，以肉眼无法观察到明显空白为标准。每次换样时，均需要换用牛皮纸并将不锈钢密闭盒清理干净，防止样品交叉污染。然后，将不锈钢密封盒关闭，按照试验要求更换不同波段UV灯管，并控制照射时间。在照射进行到一半时，将暂停照射，人工翻转土壤一次。

1.2.3 处理后土壤DNA提取及基因检测。样品经紫外线处理结束后，取70 g装入50 mL密封塑料离心管，置于-20 ℃冰箱保存，并尽快送入实验室检测。土壤样品里的微生物采用SDS裂解法配合酚氯仿（25∶24∶1）去除残余蛋白等杂质进行DNA提取，并使用Qubit 2.0 Fluorometer（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）将提取出的DNA定量，进行电泳检测（见图1），共送检42个样品。接着，根据第一次DNA结果，共选出11个土壤样品进行测序。

DNA提取后，用Covaris超声波破碎仪将其随机打断，再经过末端修复、加A尾、加测序接头、纯化以及PCR扩增等步骤完成整体的文库制备工作。构建文库完成后，首先使用Qubit 2.0进行初步定量，将文库稀释，随后使用Agilent 2100检测文库的插入片段。若插入片段大小符合预期，就使用Q-PCR法对文库的有效浓度进行准确定量。所构建文库检测合格后，按照有效浓度和目标数据量的需求将不同文库的Pooling至Illumina测序芯片进行cBot成簇，然后使用Illumina高通量測序平台进行测序，采用PE150双端测序策略。测序数据出来后，通过Factqc（http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）对数据进行质控，并去除原始数据中接头序列、含有N>5%的序列以及SQ<20且碱基大于15%的序列的数据，经过筛选获得有效数据，建库流程如图2所示。

2 结果与分析

2.1 土壤样品DNA提取结果

对送检的42个样品进行了DNA片段浸提，不同处理条件下，样品DNA片段浸提效果表现出3种现象，为可浸提的DNA片段充分（易浸提）、可浸提的DNA片段很少（难浸提）、无法浸提有效DNA（无法浸提）。不同处理条件下的浸提结果如表2所示。

由表2可知，无法浸提的DNA片段样品率在紫外波长254 nm时为37.5%，220 nm时为12.5%。这说明254 nm条件下DNA片段的降解比较充分。

2.2 土壤宏基因组提取与高通量测序

在DNA预试验的前提下，主要针对254 nm紫外波长处置后的土壤样品，选择了11个样品进行进一步的宏基因组提取与高通量测序，测序质量良好，有效率大于99.7%，Q20>95.5 %，Q30>87.9%，结果如表3所示。

2.3 ARGS在11个土壤样本中的分布组成

各样本中不同类型的ARGs丰度图如图3所示。本次试验主要关注4种抗性基因，包括氨基糖苷类（aminoglycosides）、氯霉素类（chloramphenicol）、磺胺类（sulfonamides）和四环素类（tetracycline）。11个样本抗生素抗性基因热图展示了不同类型抗生素抗性基因丰度，其单位为“抗生素抗性基因拷贝数/16S rRNA gene拷贝数”。

2.4 ARGS多样性分析

ARGS多样性分析结果显示，送检样品中所关注的上述氨基糖苷类等4种抗性基因除部分样品外，大多数有检出。从表4可看出，对于ARGs aminoglycoside和chloramphenicol来说，紫外照射有效降低了土壤的抗性基因丰度，总体来说，1 min的降低程度优于2 min。送检土壤样品关注类ARGs亚型丰度的单位为“ARGs 拷贝数/16S rRNA基因拷贝数”。对于ARGs sulfonamide来说，紫外照射时间在2 min时，抗性基因丰度有所降低。对于ARGs tetracycline来说，1 min和2 min均有所降低，但2 min的数据降低趋势更为明显。总体来说，紫外照射有效地降低了所关注的4种抗性基因的丰度，从降低的抗性基因种类数来说，1 min的时间优于2 min。

当无紫外照射时，1%的碳酸钙浓度抑制了ARGs aminoglycoside的丰度，而在1 min时，抗性基因丰度随着碳酸钙浓度的上升而增加，在2 min时，1%和5%的碳酸钙浓度均有抑制作用;对于ARGs chloramphenicol来说，碳酸钙浓度的影响较小;对于ARG ssulfonamide来说，随着碳酸钙浓度的增加，抗性基因丰度下降;对于tetracycline来说，碳酸钙的增加，抗性基因丰度有降低现象，但不是很明显。总体来说，在紫外照射条件下，碳酸钙浓度影响了抗性基因丰度，有降低现象，尤其在5%时，效果更为明显。

3 结论

紫外灯在254 nm波长下对土壤进行照射是降解土壤抗生素抗性基因丰度的有效手段之一。综合考虑来说，添加5%的石灰且使用1 min的紫外照射时间，更有利于土壤中氨基糖苷类（aminoglycosides）、氯霉素类（chloramphenicol）、磺胺类（sulfonamides）、四环素类（tetracycline）等类型抗生素的降解，该技术对抗性基因污染土壤的修复有实际指导意义。

参考文献：

[1]Zhang Q Q，Ying G G，Pan C G，et al.Comprehensive Evaluation of Antibiotics Emission and Fate in the River Basins of China：Source Analysis，Multimedia Modeling，and Linkage to Bacterial Resistance[J].Environmental Science & Technology，2015（11）：6772-6782.

[2]Rustam I A.Horizontal Gene Exchange in Environmental Microbiota[J].Front Microbiol，2011（158）：1-19.

[3]Baquero F，José-Luis M，Rafael C.Antibiotics and antibiotic resistance in water environments[J].Curr Opin Biotechnol，2008（3）：260-265.

[4] Zhang X X，Zhang T，Fang H H P.Antibiotic resistance genes in water environment[J].Applied Microbiology & Biotechnology，2009（3）：397-414.

[5]Riesenfeld C S，Goodman R M，Handelsman J.Uncultured soil bacteria are a reservoir of new antibiotic resistance genes[J].Environmental Microbiology，2004（9）：981-989.

[6]Mckinney C W，Pruden A.Ultraviolet disinfection of antibiotic resistant bacteria and their antibiotic resistance genes in water and wastewater[J].Environmental ence & Technology，2012（24）：13393.

[7]王玉童，展思辉，周启星.水环境中抗性基因去除技术研究进展[J].生态学杂志，2017（12）：3610-3616.

[8]池婷，赵震乾，张后虎，等.医疗废物堆置场地土壤抗生素抗性基因组成特征：以华东丘陵地区某医废堆场为例[J].应用与环境生物学报，2019（3）：561-569.

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