| 标题 | 清金化痰汤对慢性阻塞性肺疾病气道黏液高分泌模型大鼠表皮生长因子受体/MAPK信号通路的影响 |
| 范文 | 陈英 冯淬灵 李根茂 摘要：目的 观察清金化痰汤对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠表皮生长因子受体（EGFR）/MAPK信号通路的影响，探讨其干预COPD气道黏液高分泌的作用机制。方法 气管内滴注LPS联合烟熏方法建立COPD气道黏液高分泌模型。实验大鼠随机分为空白组、模型组、清金化痰汤组、克拉霉素组，每组10只。空白组正常饲养，其余3组分别给予生理盐水、清金化痰汤、克拉霉素片灌胃，每日1次，连续30 d。各组大鼠于实验第31日分别处死，HE染色观察肺组织病理形态及黏液腺体增生情况，实时荧光定量PCR检测肺组织EGFR、MUC5AC基因表达，免疫组化检测肺组织及气道上皮P-EGFR、P-ERK、P-JNK、P-p38、MUC5AC蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠气道上皮黏液腺体增生及P-EGFR、P-ERK、P-JNK、P-p38、MUC5AC蛋白表达显著升高（P<0.01），MUC5AC mRNA表达升高（P<0.05）；与模型组比较，清金化痰汤组大鼠气道上皮黏液腺体增生及P-p38、P-ERK、MUC5AC蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01），P-JNK蛋白表达显著升高（P<0.01）；清金化痰汤组肺组织EGFR、MUC5AC mRNA表达显著降低（P<0.01）。结论 清金化痰汤可能通过抑制EGFR下游ERK、p38信号通路，干预COPD气道黏液高分泌。 关键词：清金化痰汤；慢性阻塞性肺疾病；气道黏液高分泌；表皮生长因子受体/MAPK信号通路；大鼠 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.014 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）10-0056-07 Abstract： Objective To observe the effects of Qingjin Huatan Decoction on EGFR/MAPK signaling pathway of airway mucus hypersecretion rats with chronic obstructive pulmonary disease （COPD）. Methods Intratracheal instillation of LPS combined with smudging method was used to establish COPD airway mucus hypersecretion rat models. Experimental rats were randomly divided into blank group， model group， Qingjin Huatan Decoction group and clarithromycin group. The blank group was normally fed， while the other three groups were given NS， Qingjin Huatan Decoction， and clarithromycin respectively for gavage， once a day for 30 days. All rats were killed on the 31st day， and pathological changes of lung tissue and mucous glands hyperplasia were observed by HE staining method. The gene expressions of EGFR and MUC5AC in lung tissue were detected by RT-PCR method. The protein expressions of P-EGFR， P-ERK， P-JNK， P-p38 and MUC5AC in pulmonary tissue and airway epithelium were detected by immunohistochemical method. Results Compared with the blank group， mucous glands hyperplasia on airway epithelium， protein expressions of P-EGFR， P-ERK， P-JNK， P-p38 and MUC5AC on airway epithelium significantly increased in the model group （P<0.01）； gene expression of MUC5AC of lung tissue increased （P<0.05）. Compared with the model group， mucous glands hyperplasia on airway epithelium， P-p38， P-ERK and MUC5AC protein expression on airway epithelium in Qingjin Huatan Decoction group significantly decreased （P<0.05， P<0.01）； the protein expression of P-JNK increased significantly （P<0.01）. EGFR and MUC5AC mRNA in lung tissue in Qingjin Huatan Decoction group decreased significantly （P<0.01）. Conclusion Qingjin Huatan Decoction can reduce airway mucus hepersecrection of COPD by inhibiting ERK and p38 signal pathway on EGFR downstream. Key words： Qingjin Huatan Decoction； chronic obstructive pulmonary disease； airway mucus hypersecretion； EGFR/MAPK signaling pathway； rats 慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种严重危害人类健康，加重家庭及社会负担的慢性呼吸系统疾病。气道黏液高分泌是COPD的重要病理特征，在COPD发病率和死亡率方面起着重要作用，干预气道黏液高分泌已成为目前治疗COPD的研究热点[1-2]。研究表明，细胞表皮生长因子受体（EGFR）及其下游MAPK信号通路与气道黏液高分泌密切相关[3-4]。前期研究表明，清金化痰汤可以显著抑制COPD模型大鼠EGFR基因表达，抑制气道黏液高分泌[5]。本实验观察清金化痰汤对COPD模型大鼠EGFR/MUC5AC信号通路的影响，探讨其干预COPD气道黏液高分泌的作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物 雄性清洁级Wistar大鼠40只，6～8周龄，体质量（250±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号SCXK（京）2009-0007。饲养于北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室SPF级动物房。 1.2 药物 清金化痰汤（瓜蒌皮、黄芩、连翘、漏芦、浙贝母、清半夏、前胡、桔梗等），均为免煎颗粒剂，北京康仁堂药业有限公司；克拉霉素片，丽珠集团制药厂，0.25 g/片，批号120201。 1.3 主要试剂与仪器 LPS，美国Sigma公司；Trizol RNA提取试剂，Invitrogen公司；M-MLV反转录酶，Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒，BIO-RAD公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；实时荧光定量PCR仪，BIO-RAD公司；一抗：P-EGFR（CST，#2235，鼠源多克隆抗体），P-ERK（Santa，Sc-9476，羊源多克隆抗体），P-JNK（CST，#4668，兔源单克隆抗体），P-p38（Abcam，ab7952，兔源多克隆抗体）；二抗：DAKO二抗或HRP标记兔抗山羊二抗（1∶100），修复液：柠檬酸pH 6.0，10%山羊血清或10%兔血清；阻断剂：3%H2O2，二甲苯，梯度乙醇（无水、95%、75%）、TBS缓冲液、DAB显色剂溶液（Vector labs）。大前门牌香烟（上海卷烟厂），自制烟熏箱（60 cm×60 cm×70 cm透明有机玻璃箱），气管插管针（16号改良静脉套管针）。 1.4 分组、造模与给药 实验大鼠随机分为空白组、模型组、清金化痰汤组、克拉霉素组，每组10只。空白组正常饲养，其余3组分别给予生理盐水、清金化痰汤14 g/kg、克拉霉素药液83.3 mg/kg灌胃。每日1次，连续30 d。采用气道内滴注LPS联合烟熏的方式，复制COPD气道黏液高分泌模型[6]。3.5%水合氯醛腹腔麻醉，于实验第1、14日气管内滴注浓度为1 mg/mL的LPS溶液。将大鼠仰卧位固定在鼠板上，头高尾低呈45°角放置，暴露声门，在光源下将套管针迅速插入大鼠气管内，拔出套管针钢芯，以棉丝放在塑料套管外口判断是否成功，插管成功后，先抽取空气0.3 mL后抽取LPS溶液，通过套管针快速注入气管，然后将大鼠固定板直立旋转，左右摇晃30次，使LPS液均匀分布于两肺。插管日不烟熏，实验第2～13日、15～30日将大鼠置于自制烟熏箱内予烟熏，每次6只，用8支香烟，每日烟熏30 min。 1.5 标本制备 实验第31日取材。腹主动脉放血处死动物，取右肺中叶，4%多聚甲醛溶液固定。常规脱水、透明、浸蜡、包埋及切片（厚度6 μm）。实验过程中各组均有死亡，每组随机选取6只备检。 1.6 指标检测 1.6.1 HE染色 将肺组织切片经二甲苯Ⅲ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、蒸馏水、苏木精染液、盐酸乙醇溶液、清水、清水、氨水溶液、伊红染液、蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ后入通风橱封片。利用显微测微标尺，最小刻度单位为0.01 mm，光学显微镜下计算Reid指数（黏膜层厚度/支气管壁厚度）来表示支气管黏液腺体增生程度。其中黏膜层厚度为软骨至上皮的距离，支气管管壁厚度为上皮细胞基底膜至软骨膜内面的距离[7]。 1.6.2 RT-PCR检测 先行总RNA提取，后RT-PCR扩增。采用引物1 μL。引物序列：MUC5AC上游5'-CTGTGTCCATCTCAACCTTA-3'，下游5'-GCTGC CATCTATCCAATCA-3'，产物长度101 bp；EGFR上游5'-CATAGCAATGCGGTGAG-3'，下游5'-GAAG TCCTGCTGGTAGTCA-3'，产物长度144 bp；用β-actin基因作为内参，β-actin上游5'-CCCATCTATGAG GGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGAT TTC-3'，产物长度150 bp。反应条件：94 ℃、10 min，94 ℃、10 s，72 ℃、10 s，共45个循环。PCR反应及数据采集在CFX-96系统上进行记录。 1.6.3 免疫组化检测 石蜡切片脱蜡至水，二甲苯（三缸8 min、8 min、8 min），梯度乙醇（无水、95%、75%）每缸5 min，自来水冲洗干净后，再用蒸馏水冲洗1次。pH 6.0柠檬酸高温高压修复2 min，冷却至室温，TBS冲洗3次×5 min。3%H2O2室温20 min，TBS冲洗3次×5 min。EGFR、JNK和p38用10%山羊血清、ERK用10%兔血清孵育20 min。滴加一抗（P-EGFR一抗浓度为1∶200，P-ERK一抗浓度为1∶50，P-JNK一抗浓度为1∶75，P-p38一抗浓度为1∶50），4 ℃过夜。第2日4 ℃冰箱取出，复温15 min，TBS冲洗3次×5 min。EGFR、JNK和p38每张切片滴加50 μLDAKO二抗，室温孵育25 min，ERK每张切片滴加50 μL HRP标记兔抗山羊二抗（浓度为1∶100），室温孵育1 h，TBS冲洗3次×5 min。甩去TBS，每张切片滴加50 μL新鲜配制的DAB，镜下观察。自来水冲洗，苏木素复染2 min自来水冲洗。盐酸乙醇分化1～2 s，自来水冲洗，温水返蓝。切片放置梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片。使用Image-ProPlus6.0软件读取每个视野下阳性物质表达区域的平均光密度值。 1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，满足方差齐性时组间比较采用LSD法，不满足方差齐性时采用Tamhane's T2法进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 清金化痰汤对大鼠肺组织病理形态的影响 空白组大鼠气道黏膜上皮完整，纤毛无粘连、倒伏及脱落，上皮细胞无空泡变性及坏死脱落，极少有杯状细胞，黏膜下腺体无增生、肥大。支气管管壁无充血、水肿，无淋巴细胞及浆细胞浸润，支气管腔内无分泌物形成，管壁平滑肌束无断裂、萎缩，肺泡间隔稍有变薄、少量融合。与空白组比较，模型组纤毛粘连、倒伏、脱落明显，上皮细胞增生、增厚，且存在明显坏死脱落，杯状细胞增生，黏膜下腺体增生、肥大。支气管壁及支气管周围淋巴细胞及浆细胞明显聚集浸润，管壁平滑肌束断裂、萎缩。肺泡间隔明显变薄并断裂、毛细血管减少，相邻肺泡广泛融合形成较大囊腔，典型肺气肿表现，肺间质血管充血明显。与模型组比较，清金化痰汤组纤毛粘连、倒伏、脱落，杯状细胞增生，肺泡间隔变薄，相邻肺泡隔融合均显著减轻，支气管壁轻微水肿，淋巴细胞浸润，管壁平滑肌束断裂、萎缩，肺间质淋巴细胞浸润、充血。克拉霉素组纤毛粘连、倒伏、脱落，上皮细胞存在坏死脱落，杯状细胞增生程度较轻，支气管壁淋巴细胞浸润，管壁平滑肌束萎缩。肺泡间隔明显变薄，相邻肺泡隔融合与模型组相比减轻，肺间质淋巴细胞浸润、充血。结果见图1。 2.2 清金化痰汤对大鼠气道上皮黏液腺体增生的影响 与空白组比较，模型组Reid值显著升高（P<0.01）；与模型组比较，清金化痰汤组、克拉霉素组Reid值均显著降低（P<0.01）；清金化痰汤组与克拉霉素组Reid值比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。 2.3 清金化痰汤对大鼠肺组织细胞表皮生长因子受体、黏蛋白5AC基因表达的影响 总RNA样品经琼脂糖凝胶电泳之后，紫外灯下观察可见18 s、28 s两条清晰的条带，未被降解。紫外分光比色测定显示，所有RNA样品在260、280 nm处A值之比均在1.8～2.0之间，纯度符合要求，各目标融解曲线均为单一峰，扩增曲线均呈平行分布。与空白组比较，模型组MUC5AC mRNA表达升高（P<0.05），EGFR mRNA表达无差异（P>0.05）。与模型组比较，清金化痰汤组EGFR、MUC5AC mRNA表达显著降低（P<0.01）；克拉霉素组EGFR mRNA表达显著升高（P<0.01），MUC5AC mRNA表达降低（P<0.05）；与克拉霉素组比较，清金化痰汤组EGFR、MUC5AC mRNA表达降低（P<0.05，P<0.01）。 2.4 清金化痰汤对大鼠肺组织及气道上皮P-细胞表皮生长因子受体蛋白表达的影响 肺组织轮廓清晰，其中棕黄色区域为阳性蛋白表达。可见P-EGFR主要表达在小气道。与空白组比较，模型组气道上皮P-EGFR表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，清金化痰汤组和克拉霉素组气道上皮P-EGFR表达均无差异；与克拉霉素组比较，清金化痰汤组气道上皮P-EGFR表达显著升高（P<0.01）。 2.5 清金化痰汤对大鼠肺组织及气道上皮P-ERK蛋白表达的影响 肺组织轮廓清晰，其中棕黄色区域为阳性蛋白表达。可见P-ERK主要表达在小气道，在肺组织中也有表达。与空白组比较，模型组气道上皮P-ERK表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，清金化痰汤组和克拉霉素组气道上皮P-ERK表达显著降低（P<0.01）；与克拉霉素组比较，清金化痰汤组气道上皮P-ERK表达显著升高（P<0.01）。 2.6 清金化痰汤对大鼠肺组织及气道上皮P-JNK蛋白表达的影响 肺组织轮廓清晰，其中棕黄色区域为阳性蛋白表达。可见P-JNK主要表达在小气道，肺组织内也可见少量表达。与空白组比较，模型组气道上皮P-JNK表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，清金化痰汤组气道上皮P-JNK表达显著升高（P<0.01），克拉霉素组气道上皮P-JNK表达显著降低（P<0.01）；与克拉霉素组比较，清金化痰汤组气道上皮P-JNK表达显著升高（P<0.01）。结果见图4、表5。 2.7 清金化痰汤对大鼠肺组织及气道上皮P-p38蛋白表达的影响 肺组织轮廓清晰，其中棕黄色区域为阳性蛋白表达。可见P-p38主要表达在小气道，在肺组织中也可见少量表达。与空白组比较，模型组气道上皮P-p38表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，清金化痰汤组和克拉霉素组气道上皮P-p38表达显著降低（P<0.01）；与克拉霉素组比较，清金化痰汤组气道上皮P-p38表达无差异。 2.8 清金化痰汤对大鼠肺组织及气道上皮MUC5AC蛋白表达的影响 肺组织轮廓清晰，其中棕黄色区域为阳性蛋白表达。可见MUC5AC主要表达在小气道。与空白组比较，模型组气道上皮MUC5AC表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，清金化痰汤组和克拉霉素组气道上皮MUC5AC表达均降低（P<0.05）；与克拉霉素组比较，清金化痰汤气道上皮MUC5AC表达无差异。 3 讨论 气道黏液高分泌是COPD的重要特征，多种细胞信号通路参与黏液分泌调节。EGFR是受体酪氨酸激酶EerbB家族成员[8]。Takeyama研究表明，EGFR在黏蛋白MUC5AC合成及杯状细胞增生起着关键作用[9]。EGFR磷酸化后，激活多条下游通路——MAPK信号通路、PI3K 信号通路和PKC信号通路[10]。进一步研究表明，EGFR及下游MAPK信号通路诱导了气道上皮细胞黏蛋白表达上调[11-12]。 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联激活是多种信号通路的中心。研究表明，MAPK相关的信号通路（包括ERK、JNK、p38）在诱导气道上皮细胞合成和分泌黏蛋白过程中发挥了非常重要的作用[13]。 ERK是MAPK家族的重要成员之一，是胞内极为重要的信号转导分子。多项研究表明，肺炎链球菌、白细胞介素-1β及肿瘤坏死因子-α可通过ERK信号通路诱导MUC5AC基因高表达[14-15]。抑制ERK磷酸化，可以降低气道黏液高分泌[16]。 JNK信号通路功能失调可造成慢性炎症的发生[17]。JNK因不同因素诱导黏蛋白生成中发挥作用不同。香烟烟雾[18]、LPS[19]可通过激活JNK信号通路诱导MUC5AC合成，而肺炎链球菌诱导的气道MUC5AC表达，JNK则起负性调节作用。 p38通路与炎症和应激反应的调控密切相关[20-21]。非典型流感嗜血杆菌通过激活p38信号通路，上调MUC5AC表达[22]。目前，p38MAPK已成为抗炎疗法中重要的潜在靶点。 COPD属中医学“肺胀”范畴，COPD急性发作期，痰热壅肺为其主要病机[23]。清金化痰汤为北京中医药大学东直门医院武维屏教授治疗COPD的经验方，以清热化痰理气为法，热清使痰无助长之因，痰消使热无生长之源，同时顺应肺主宣发肃降的生理特性，使肺之气机通畅，痰热得消，从而恢复机体的功能状态，缓解气道黏液高分泌状态。本方由清金化痰方化裁而成，方中瓜蒌皮性寒，味甘，主清热化痰、宽胸理气。黄芩，《本草正》载其“枯者清上焦之火，消痰利气，定喘咳”。二者相合，共奏清热化痰之效，为君药。连翘、漏芦为清热解毒之品，武维屏教授将之用于肺部感染、支气管扩张等呼吸系统感染性疾病，收效良好。清半夏，《本经逢原》载“半夏同苍术、茯苓治湿痰；同瓜蒌、黄芩治热痰；同胆南星、前胡治风痰；同芥子、姜汁治寒痰。惟燥痰宜瓜蒌、贝母，非半夏所能治也”。前胡，《药义明辨》载“其功先在散结，结散则气下，而痰亦降，所以为痰气要药”。浙贝母苦寒，《本草纲目拾遗》载“解毒利痰，开宣肺气，凡肺家夹风火有痰者宜此”。桔梗，苦、辛，归肺经，“开胸膈，除上气壅……逐肺热，住咳，下痰，治肺痈排脓”（《本草蒙筌》）。诸药相合，寒温适宜，助君药清热、化痰、理气、止咳。全方配伍得当，共奏清热化痰理气之功。前期研究表示，该方具有抗炎、减少MUC5AC合成的作用[24]。 有研究表明，EGFR以及其下游信号通路的激活被认为是COPD气道黏液高分泌的重要参与因素[25-26]。应用EGFR抑制剂，可以显著抑制黏液高分泌[27]。 清金化痰汤可显著抑制EGFR mRNA表达，但对P-EGFR蛋白表达无影响，观察其最终对黏蛋白的影响，结果显示MUC5AC mRNA及蛋白表达均显著降低。在EGFR诱导的MUC5AC合成过程中，其下游信号通路的激活起着重要作用。抑制ERK、JNK、p38的激活，可明显抑制气道黏液高分泌[28]。有研究表明，ERK信号通路与EGFR介导的MUC5AC分泌关系密切[29]。本研究中，清金化痰汤显著抑制气道上皮P-ERK表达。p38 MAPK作为抗炎疗法中的重要靶点，清金化痰汤可显著抑制P-p38的表达，减轻气道炎症。有研究表明，JNK信号通路在MUC5AC合成中起负性调节作用[14]。清金化痰汤上调了气道上皮P-JNK表达，表明P-JNK可能在MUC5AC合成中起负性调节作用。清金化痰汤对MAPK信号通路的上游信号分子EGFR无影响，考虑一方面可能与EGFR自身复杂的生物学特性、EGFR信号通路多面性及时空特异性调节特点相关[30-31]，另一方面与免疫组化检测方法的局限性有关。另外，与克拉霉素组比较，清金化痰汤组可显著抑制大鼠肺组织EGFR mRNA表达，但最终清金化痰汤组大鼠气道上皮P-EGFR蛋白表达显著高于克拉霉素组。研究显示，真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位点存在时空间隔；在基因转录后，还有转录后加工、转录产物的降解、翻译、翻译后加工、降解及修饰很多层面，检测的时间点不同，均会使mRNA水平和蛋白水平出现不完全一致[32]。 综上所述，清金化痰汤可能通过抑制EGFR下游信号通路中ERK、p38信号通路，干预COPD气道黏液高分泌，其具体机制将在后续的实验中进一步研究。 参考文献： [1] FAHY J V， DICKEY B F. 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