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标题 复方龙芩草微乳提取液有效成分体外抗H1N1流感病毒的药效研究
范文 刘晓艳++李妍++刘帅++李卫飞++顾立刚++刘晓婷



摘要：目的 研究复方龙芩草微乳提取液中有效成分体外抗H1N1流感病毒增殖的作用，观察微乳提取液中有效成分对流感病毒的抑制率。方法 用均匀设计法安排实验，MTT法检测药物对H1N1流感病毒致A549细胞病变的抑制效率（ER），以ER为指标，运用Minitab17软件建立数学模型得出各因素之间的回归方程，分析各成分对ER的作用关系并优选出具有最佳抗H1N1流感病毒效果的有效成分比例。结果 复方成分中，黄芩苷发挥最显著的抗病毒作用，甘草苷对细胞病变有一定的抑制作用，5种成分对ER存在协同或制约性的关系。每毫升药液含甘草苷、黄芩苷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸分别为13.94 μg、49.44 μg、0.23 mg、1.25 mg、2.50 mg时ER值最佳，经验证ER值为85.34%±4.72%。结论 复方龙芩草微乳提取液有效成分的优化组合能较好发挥抗H1N1流感病毒的作用。
关键词：复方龙芩草；微乳提取液；均匀设计；H1N1流感病毒；A549细胞
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）01-0049-06
Study on Anti-influenza Virus H1N1 Activity of Main Ingredients from Microemulsion Extract of Compound Longqincao in Vitro LIU Xiao-yan1， LI Yan1， LIU Shuai1， LI Wei-fei1， GU Li-gang2， LIU Xiao-ting2， DU Hong1 （1.School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. Educational Ministry Key Laboratory of Preventing and Treating Viral Diseases with Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）
Abstract： Objective To study the effects of main ingredients from microemulsion extract of Compound Longqincao in vitro on anti-influenza virus H1N1 activity； To analyze effects of main ingredients from microemulsion extract on influenza virus inhibition rate. Methods Uniform design was used to conduct the experiment. MTT method was used to detect the effect rate （ER） of anti-influenza virus H1N1 on A549 cells. Setting ER as the index， Minitab17 software was used to establish mathematical model to come up with regression equations of all factors. The effects of ingredients on ER were analyzed and the efficient composition ratio of the optimum anti-influenza virus H1N1 was chosen. Results In the compound compatibility， baicalin showed the most obvious antivirus activity， and licorice glycosides had certain inhibition effects on pathological changes of cells. Five ingredients had coordinative or controlled relation with ER. When per milliliter liquids containing licorice glycosides， baicalin， leucine， aspartic acid， glutamic acid was 13.94 μg， 49.44 μg， 0.23 mg， 1.25 mg， and 2.50 mg， ER was the best. ER was 85.34%±4.72% after verification. Conclusion The optimized combination of main ingredients from microemulsion extract of Compound Longqincao can better play a role in anti-influenza virus H1N1.
Key words： Compound Longqincao； microemulsion extract； uniform design； H1N1 influenza virus； A549 cells
甲型H1N1流感是由H1N1流感病毒引起的一种
基金项目：国家自然科学基金（81102815）；教育部博士点新教师基金（20110013120017）；北京中医药大学研究生自主课题（2016-JYB-XS069）
通讯作者：杜红，E-mail：duhong@vip.163.com
传染迅速、死亡率高的呼吸道传染病[1]。复方龙芩草由黄芩、甘草和地龙3味中药组成，具有清肺利咽、解毒泻热之功效[2-3]，对甲型H1N1流感具有较好的抵抗效果[4]。复方龙芩草微乳提取液是以生物相容性微乳为溶剂，运用渗漉法对复方龙芩草进行提取而得，能较好地抑制H1N1流感病毒增殖[5]。近年来，中药有效组分或成分配伍研究逐渐受到青睐，复方中有效成分配伍往往可提高疗效，改善复方成分复杂、作用机制不明确的缺陷[6]，均匀设计法在复方有效成分或组方配伍的药效筛选中具有明显的优势[7-8]。本实验以复方龙芩草微乳提取液中含量较高的成分黄芩苷、甘草苷及地龙中的氨基酸为基础，从细胞水平探讨其对H1N1流感病毒致细胞病变的抑制作用，拟设计出药效物质基础明确、安全有效的抗H1N1流感病毒的有效成分组方，为后续研究提供思路。
1 实验材料
1.1 病毒和细胞
甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株，中国中医科学院提供，-75 ℃冷藏，血凝滴度为2～7。人肺腺癌细胞（A549），中国协和医科大学基础医学院细胞中心。
1.2 药物
甘草苷（批号111610-201106，40 mg/支）、黄芩苷（批号110715-201318，100 mg/支）、谷氨酸（批号140690-201203，100 mg/支）、天冬氨酸（批号140691-200401，100 mg/支）、亮氨酸（批号140687- 201102，100 mg/支），中国食品药品检定研究院；磷酸奥司他韦胶囊（达菲，75 mg/粒），瑞士巴塞尔豪夫迈罗氏公司，批号H20044397。
1.3 主要试剂与仪器
胎牛血清、McCoy's 5A培养基，美国Gibco公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲亚砜（DMSO），Sigma公司；0.25%胰酶-0.02%EDTA，北京普博欣生物科技有限公司；三联溶解液（含SDS 10 g、异丁醇5 mL、10 mol/L HCl 0.1mL）；细胞培养液：McCoy's 5A培养基（含10%胎牛血清和1%青-链霉素）；细胞维持液：McCoy's 5A培养基（含2%胎牛血清和1%青-链霉素）。细胞培养箱（BINDER WMK-02型），光学显微镜（日本Olympus公司），荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），超净工作台（北京碧都净化设备有限公司），酶标仪（北京普朗新技术有限公司），水浴箱（北京医疗设备厂），Astell全自动高压灭菌器（北京东迅天地医疗仪器有限公司）。
2 实验方法
2.1 细胞毒性实验
从-75 ℃冰箱取出A549细胞复苏，传代3～4次，细胞生长良好时以0.25%胰酶-0.02%EDTA消化细胞，用细胞培养液调整细胞浓度为1.5×108个/L，充分混匀后将该细胞液以每孔100 μL加入96孔板中，35 ℃、5%CO2培养箱培养数小时使细胞以单层状态铺满培养瓶底层。用细胞维持液将黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和达菲分别连续对倍递次稀释至不同浓度，加入96孔板中，每孔100 μL，每个浓度平行设6个复孔，同时设正常细胞对照组。35 ℃、5%CO2培养箱培养48 h，加入MTT（终浓度为0.5 mg/mL），培养4 h后每孔加100 μL SDS，继续培养12 h，于酶标仪波长570 nm处测定细胞吸光度（A）值，计算细胞存活率（实验组A值÷正常细胞对照组A值×100%）。
2.2 病毒致细胞病变实验
取已长成单层细胞的96孔板，吸出培养液，每孔加PBS清洗2次，每孔接种100 ?L 100TCID50病毒液，37 ℃、5%CO2培养箱中吸附2 h后吸出病毒液，加入最大无毒浓度下6个相应稀释度的黄芩苷、甘草苷、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸溶液，以达菲为阳性对照组，同时设正常细胞对照组和病毒对照组，每孔100 ?L，每浓度设4个复孔。37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h观察结果，细胞病变效应（CPE）用0%～25%（+）、25%～50%（++）、50%～75%（+++）、75%～100%（++++）表示，当病毒对照组CPE为++++时记录结果。随后加入MTT（终浓度为0.5 mg/mL），每孔10 ?L，4 h后加100 ?L/孔SDS，培养8 h，于酶标仪波长570 nm处测定A值。计算药物抗病毒效率（ER）。ER（%）=（药物组平均A值-病毒对照组平均A值）÷（正常细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值）×100%。实验重复2次。
2.3 均匀试验设计
根据每个有效成分对流感病毒的ER及对细胞形态的影响情况设置均匀试验的上下限，根据均匀设计水平数不得少于2倍因素数的原则，本试验采用5因素10水平[U10*（105 ）]设计试验，D=0.241 4，指标数为1，见表1。
2.4 细胞病变抑制率测定
根据表1安排的试验进行药物组分对细胞病变抑制率检测，取已长成单层细胞的96孔板，吸出培养液，每孔加入100 ?L 100TCID50病毒液，37 ℃、5%CO2培养箱吸附2 h后，吸出病毒液，加入表1中的10组药液，每孔100 ?L，以达菲为阳性药物对照组，同时设正常细胞对照组和病毒对照组，每浓度设6个复孔，继续培养48 h后加入MTT（终浓度为0.5 mg/mL），继续培养4 h，加SDS，12 h后于酶标仪波长570 nm处测定A值，计算ER。实验重复2次。
2.5 组分配比的优选
根据均匀试验结果，运用Minitab17软件对结果进行分析处理，探讨各成分对抗病毒效率的影响及相互关系，并优选出具有最佳抗H1N1流感病毒效果的5种有效成分的配比。
2.6 最佳抗病毒效果的验证
取已长成单层细胞的96孔板，吸出培养液，加入PBS清洗细胞2次，按“2.4”项下方法进行操作，实验重复3次，验证有效成分配比的ER。
3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 有效成分的细胞毒性
较高浓度黄芩苷可使A549细胞变圆、破碎、折光率增加，当浓度为50 μg/mL时细胞存活率变化不明显，细胞形态、折光率、数量与正常细胞对照组无明显差异，25 μg/mL时与空白对照组比较，细胞形态几乎无变化。甘草苷对细胞形态的影响与黄芩苷相似，浓度为25 μg/mL时细胞形态、贴壁状态等与空白对照组比较无显著差异。天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸浓度均为5 mg/mL时，对细胞基本无毒性，与空白对照组比较无明显差异。
4.2 有效成分对病毒致细胞病变抑制率的影响
当黄芩苷浓度为50 μg/mL，ER值为87.810%± 1.905%时，对病毒致细胞病变的抑制作用最明显，随黄芩苷浓度降低，ER值逐渐变小。甘草苷浓度在25 μg/mL时能部分抑制细胞的病变，ER值也随浓度的降低而下降，二者ER均呈一定的量效关系，见表2。天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸抗病毒效果不明显，但在2.5～0.625 mg/mL浓度范围内，ER值大于空白对照组。
4.3 药物不同配比对细胞病变抑制率的影响
根据“4.2”项中5个成分在细胞安全的剂量范围内ER值的大小，将每毫升药液中黄芩苷、甘草苷的用量范围分别设为50～12.5 μg和25～12.5 μg，结合氨基酸对细胞形态变化的影响，设亮氨酸用量范围为2.5～0.625 mg，天冬氨酸为1.25～0.625 mg，谷氨酸为2.5～1.25 mg。均匀试验设计及结果见表3。
4.4 数学模型的建立
4.4.1 回归方程的建立 运用Minitab17.0软件处理均匀试验结果，运用逐步回归分析法，引入对ER显著变量，剔除不显著变量，拟合得到回归方程Y=0.357 700-0.003 248X2+0.025 440X1+0.000 525X22+0.001 958X52-0.001 213X1X2-0.086 280X3X4-0.000 418X2X3X5，其系数的显著性检验和方差分析见表4、表5。从表4可以看出，在回归方程模型中，除X52项外，其他各项系数均P<0.05，表5中回归方程P<0.001，说明该模型表示的指标与各变量间的关系具有统计学意义，方程拟合良好。回归方程残差图见图1。
回归方程的实测相关系数R2为0.999 8，近似于预测相关系数0.999 5。图1显示，正态概率分布拟合良好，各组实验值围绕残差等于0的直线上下随机分布，从另一个角度说明回归方程对原观测值的拟合情况良好，复方龙芩草微乳提取液中有效成分与指标ER之间存在显著的线性相关关系，运用此方程能够预算变量范围内的指标效应值。
4.4.2 各成分与抗病毒效率间的关系分析 从回归方程及方差分析表可以看出，对ER值影响最显著的项为X22，可使抗病毒效率显著增加；其次是X1，在一定程度上也可增加ER值。对ER值影响最显著的交互项是X1X2，其次是X3X4，表3中X1、X2及二者乘积项系数的方差膨胀因子均大于10，具有较强的多重共线性关系，也可以说明二者存在一定的交互作用，而X52和其他几个自变量的交互作用不强。通过等值线图可以较为直观地反映出各变量之间的关系，见图2～图6。
图2中，X1值为12.50～22.22时，随着X2值的增加，ER值也随之增加，当X1值为12.50～16.66时，随着X2值的增加，ER值增加最明显；当X2值为29.00～33.33时，随着X1值的增加，ER值无明显变化。
图3中，当X3值<1.665时，ER值随着X2浓度的增大而增加；当X2取任意值时，ER随着X3浓度的增加而降低，X2值>40时变化最明显。说明X2浓度较大时，X3的浓度对ER值影响较明显。
图4中，当X4值在0.625～0.972时，ER值随X2浓度的增大而增加，而其他浓度范围对ER值和X2的关系无明显影响；当X2值较小时，X4浓度对ER值无规律性的影响。
图5中，X5值在1.666～2.083时，ER值随X2浓度的增大而增加，反之X2值固定，X5浓度对ER值也无规律性的影响。可见X4、X5与X2在抗病毒效率方面仅略有交互作用。
图6中，X4值为0.834时，ER值随着X3浓度的增加而降低，并且在二者浓度较低的情况下对ER的影响较大。
4.5 组分配比的优选
Minitab17软件中的Response Optimizer响应优化器在单指标和多指标的优化实验中可起到较好的效果[9]。本实验对影响病毒致细胞病变抑制率较为显著的几个变量进行了优化，当设定ER的拟合值为95%时，回归方程中各项优化值见图7。考虑到实际药物的最大无毒浓度及操作需要，经计算5个成分在每毫升药液中的比例X1∶X2∶X3∶X4∶X5为13.94 μg∶49.44 μg∶0.23 mg∶1.25mg∶2.50 mg，此比例优化得到的ER理论值在89.78%～100.22%之间。
4.6 抗病毒效率的验证
为验证本实验的可靠性，采用优选出的比例对复方龙芩草微乳提取液中黄芩苷、甘草苷、亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸进行抗H1N1流感病毒效率的验证。实验重复3次，得到的ER值为85.34%±4.72%，基本与模型预测值一致，验证结果表明优化结果可信度高。
5 讨论
流感病毒是流行性感冒的主要致病因素，甲型H1N1流感病毒是主要的一种。黄芩、板蓝根等单味中药[10-11]以及复方制剂[12-13]具有良好的抗病毒效果。
微乳是近年来药物新剂型的研究热点，作为药物载体可以显著增溶不同极性的药物成分[14]，用微乳提取蛋白质可有效缩短提取时间，维持蛋白质的活性[15-16]。生物相容性微乳是本实验室自行研发的，在尽量遵守人体内的胆固醇、卵磷脂、胆盐含量比例的前提下制备的澄清透明的热力学稳定体系，该微乳不仅能提取黄芩、甘草中的植物化学成分，还能提取地龙中的游离氨基酸、部分蛋白质类成分，充分发挥对动、植物中药化学成分的捕集作用。前期实验测定该微乳液中黄芩苷、甘草苷及天冬氨酸、亮氨酸和谷氨酸的含量高，加之黄芩苷具有显著的抗H1N1流感病毒作用[17-18]，本研究在测定各成分对细胞的毒性及ER的基础上筛选出发挥最佳抗病毒作用的配方。
本实验选择了对呼吸系统疾病造模效果优于MDCK细胞模型的A549细胞进行病毒致细胞病变作用的研究，与正常细胞比较，A549细胞对病毒的毒力耐受性更强，更适合流感病毒的感染，更贴近呼吸系统模型的研究需要，可大大降低实验失败率，A549细胞已成为流感病毒体外实验研究所用的主要细胞之一[19]。
对中药复方或有效成分配伍的研究，运用均匀试验设计能够避免多因素产生较多的实验次数，在较少的实验组别上获得药效理想的组方或组分配比[20]。Minitab17软件为实验模型的建立和分析提供了强大的可信度和准确性，利用Response Optimize优化器优化的复方龙芩草微乳提取液中主要成分黄芩苷、甘草苷、亮氨酸、天冬氨酸和谷氨酸比例的ER值可达到85.34%±4.72%，可能是由其他不可控因素引起的误差，使该值略低于理论值。从回归方程及等值线图可知，发挥抗病毒作用最显著的变量为X2（黄芩苷），能够显著增加对病毒致细胞病变的抑制率，其次是X1（甘草苷），对细胞病变也有一定的抑制作用，X2与X1、X4、X5之间和X3、X4之间均存在交互作用，5种成分之间存在协同或制约性的关系，X3、X4、X5未被引入方程，即三者对抗病毒致细胞病变抑制率无明显影响，但在一定程度上影响其他成分对ER的贡献大小。由此可见，复方龙芩草微乳提取液中有效成分发挥抗H1N1流感病毒的作用并非由单一成分决定，而是多种成分综合作用的结果。本研究为药效物质基础明确、安全有效的有效成分组方的研究以及复方龙芩草微乳提取液的抗病毒作用机制研究提供了一定的参考。
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（收稿日期：2016-03-29）
（修回日期：2016-04-25；编辑：华强）
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