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标题	应用ITS2条形码鉴定藏药镰形棘
范文	豆黄聪 琳郭敏 王晓琳 姜华 摘要：目的 对藏药镰形棘豆及其易混伪品进行分子鉴定，以确保该药材的质量及临床疗效。方法 提取样本基因组DNA，对核基因ITS2片段进行PCR扩增并测序，并对所得序列进行同源性比較，利用MEGA软件进行相关数据分析，并构建基于ITS2序列的邻接（NJ）树。结果 镰形棘豆物种种内K2P遗传距离为0，与其他混伪品的K2P遗传距离分布于0.068～0.084，构建的NJ树表明ITS2序列能够区分镰形棘豆与其他易混伪品。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别镰形棘豆及其易混伪品，为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。 关键词：镰形棘豆；DNA条形码；ITS2；分子鉴定 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019 中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0076-03 镰形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我国青藏高原常用的民间草药之一，收载于1995年颁布的《卫生部药品标准》藏药第一册。全草入药，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎疗效，被誉为藏医“三大抗炎药”之一，是奇正消痛贴膏、青鹏膏剂、流感丸、藏红花油、棘豆扶正胶囊等多种藏药复方或成药的主要药物。王栋等[2]实验研究显示，镰形棘豆具有良好的外周镇痛活性，对急性炎症和慢性炎症都有较好的作用。其黄酮类成分具有抗炎与抗氧化活性[3]。有研究报道，镰形棘豆活性成分对胃癌、肝癌细胞株具有较强的细胞毒 但至目前为止，对藏药镰形棘豆生药鉴定方面的研究还非常薄弱，并且只见于利用传统方法进行鉴定[8]。棘豆属近缘种植物，尤其是同生境分布的近缘种，产地来源相同、表型具有趋同性、形态特征相似，往往很难通过传统的基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定等方法进行准确鉴别。因此，本研究提出采用DNA条形码（DNA barcoding）的方法对镰形棘豆及其易混伪品砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆等进行分子鉴定。 DNA条形码技术利用短的、标准的DNA序列片段对物种进行分子鉴定[9]。因其是基于物种基因的检测，而不是与环境密切相关的表现型，避免了人为因素和客观条件的影响，为生药鉴定提供了本质依据，适用于对中药材进行真伪鉴定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之间，在物种水平的变异较快，已被用于多个物种的DNA条形码鉴定[11-13]。本研究利用ITS2条形码对镰形棘豆及其易混伪品进行比较研究，旨在为该药材的质量控制、临床安全用药及合理开发利用提供分子依据。 1 仪器与试药 共20个样本，来自7个物种，包括样品及Genbank下载序列。样品由兰州大学生命科学学院副教授盛红梅进行鉴定，凭证标本保存于甘肃省中医药研究院中药研究所。样品及GenBank下载序列见表1。 低温高速离心机（Eppendorf，德国），恒温水浴锅（科哲，中国上海），PCR仪（Bio-Rad，美国），水平电泳仪（Bio-Rad，美国），凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）。 植物DNA提取试剂盒、dNTP Mix、PCR buffer（10×）、Taq酶，北京天根生物技术有限公司；定量Marker DS2000，广东东盛生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。 2 方法 2.1 样品总DNA提取 称取100 mg样品组织，在预冷的研钵中进行快速充分研磨，然后利用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。经琼脂糖凝胶电泳检测后，置4 ℃冰箱保存备用。 2.2 目的序列PCR扩增 ITS2序列扩增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3'，反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反应体系25 μL，包括：DNA模板0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 20 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程有限公司完成测序。 2.3 数据处理与分析 对测序峰图进行校对，去除引物区，使用基于HMM的注释方法[14]，去除两端5.8s和28s区段，获得ITS2间隔区序列。将所有序列用Clustal X软件进行多序列比对，利用MEGA软件分析比对，并基于K2P模型计算序列间进化距离，用邻接（NJ）法构建系统聚类树。利用自展Bootstrap检验评价各分支的支持率，1000次重复。 3 结果 3.1 PCR产物电泳检测 采用ITS2序列引物对采集样本基因组DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结。 3.2 种内与种间变异分析 20个样本的ITS2序列平均长度为211 bp；GC含量差异较小，分布于51.2%～52.8%，平均GC含量为51.8%。K2P遗传距离分析表明，镰形棘豆种内的遗传距离为0，镰形棘豆与其易混伪品种间平均K2P距离为0.075，分布于0.068～0.084。 3.3 聚类分析 基于ITS2序列，利用软件MEGA构建的NJ系统聚类树显示，不同来源的镰形棘豆样本聚为一支，表现出单系性，自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆也分别聚为独立的支，与镰形棘豆区分明显。 4 讨论 由于棘豆属一些物种形态相似，镰形棘豆与相同生境的同属近缘植物难以辨识。棘豆属其他植物如甘肃棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16]，采食有毒棘豆属植物后常会引发动物发生中枢神经抑制、呼吸抑制，引起中毒乃至死亡，或导致动物流产、畸形[17]。伪品混用严重影响真品镰形棘豆的用药安全，因此，对镰形棘豆药材的准确鉴定至关重要。本研究发现，ITS2作为DNA条形码序列，可以有效便捷地鉴别镰形棘豆与砂珍棘豆、小花棘豆、猫头刺和甘肃棘豆等易混伪品，具有重要的应用价值。 参考文献： [1] 姜华，胡君茹，刘霞.镰形棘豆的研究进展[J].中草药，2006，37（2）：314-315. [2] 王栋，杨欢，童丽，等.藏药镰形棘豆的镇痛抗炎活性[J].药学与临床研究，2008，16（2）：90-93. [3] WANG D， TANG W， YANG G M， et al. Anti-inflammatory， antioxidant and cytotoxic activities of flavonoids from Oxytropis falcate Bunge[J]. Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8（6）：461-465. [4] 闫海燕.镰形棘豆中两种黄酮的结构及生物活性研究[J].宝鸡文理学院学报：自然科学版，2008，28（2）：120-122，126. [5] 杨光明，张芳芳，王栋，等.镰形棘豆对SMMC-7721肝癌细胞增殖及MMP-2表达的影响[J].中国中药杂志，2011，36（9）：1227-1230. [6] 陈锦珊，洪佳妮，杜青云，等.镰形棘豆黄酮类化合物对紫外线辐射引起的角质形成细胞损伤的保护作用[J].解放军药学学报，2011，27（4）：289-292. [7] 戴衍朋，杨欢，童丽，等.镰形棘豆止血作用初步研究[J].南京中医药大学学报，2008，24（2）：107-108，126. [8] 姜华，詹文强，刘霞.藏药镰形棘豆的生药学鉴定[J].中国中药杂志， 2007，32（24）：2664-2666. [9] MILLER S E. DNA barcoding and the renaissance of taxonomy[J]. Proceedings of the National Academy of Science，2007，104（12）：4775-4776. [10] 陈士林，姚辉，宋经元，等.基于DNA barcoding（条形码）技术的中药材鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化，2007，9（3）：7-12. [11] 李妮，陈科力，刘震，等.景天属药用植物DNA条形码研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2010，12（3）：462-467. [12] TING G， HUI Y， SONG J Y， et al. Identification of medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2[J]. Journal of Ethnopharmacology，2010，130（6）：116-121. [13] 倪梁紅，扎西次仁，赵志礼，等.藏药冬那端赤的分子生药学研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21（3）：65-68. [14] KELLER A， SCHLEICHER T， SCHULTZ J， et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J]. Gene，2009，430（1/2）：50-57. [15] 沈明华，莫重辉，赵宝玉，等.家兔实验性甘肃棘豆中毒的临床症状和病理形态学观察[J].动物医学进展，2010，31（1）：442-449. [16] 卢萍，赵萌莉，韩国栋.小花棘豆毒性的危害与利用[J].草业科学， 2009，26（3）：97-101. [17] 杨小平.动物棘豆属疯草中毒的临床症状[J].武汉科技学院学报， 2002，15（3）：25-28. （收稿日期：2015-09-09） （修回日期：2015-11-02；编辑：陈静）
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