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标题 HPLC测定温阳振衰颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量
范文 杨磊+张曼华+蔡虎志+石继连



摘要：目的 采用反相高效液相色谱法同时测定温阳振衰颗粒中人参皂Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量。方法 采用Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），流动相为乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脱（0～35 min，19%乙腈；35～58 min，19%～29%乙腈；58～70 min，28%乙腈；70～100 min，29%～40%乙腈），流速1.0 mL/min，检测波长203 nm，柱温35 ℃。结果 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的进样量分别在0.22～2.2 ?g、0.22～2.2 ?g、0.26～2.6 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数分别为0.999 8、0.999 8、0.999 1；人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的平均回收率分别为98.04%、96.58%、96.75%。结论 本方法准确、灵敏度高、重复性好，可作为温阳振衰颗粒的质量控制方法。
关键词：温阳振衰颗粒；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.019
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）04-0075-04
Content Determination of Ginsenoside Rg1， Ginsenoside Re and Ginsenoside Rb1 in Wenyang Zhenshuai Granules by HPLC YANG Lei1， ZHANG Man-hua2， CAI Hu-zhi1， SHI Ji-lian2 （1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 2. Key Discipline of Processing Chinese Materia Medica of SATCM， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）
Abstracts： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 in Wenyang Zhenshuai Granules. Methods The separation was preformed on Agilent TC-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 ?m）. The mobile phase consisted of acetonitril-0.05% aqueous solution of phosphoric acid with gradient elution （0–35 min， 19% acetonitrile； 35–58 min， 19%–29% acetonitrile； 58–70 min， 28% acetonitrile； 70–100 min， 29%–40% acetonitrile）. The flow rate was 1.0 mL/min； the wavelength of detector was 203 nm； the temperature of column was 35 ℃. Results The calibration curves showed good linearity in the range of 0.22–2.2 ?g （ginsenoside Rg1， r=0.999 8）， 0.22–2.2 ?g （ginsenoside Re， r=0.999 8） and 0.26–2.6 ?g （ginsenoside Rb1， r=0.999 1）， respectively. The average recoveries of ginsenoside Rg1， ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 were 98.04%， 96.58% and 96.75%， respectively. Conclution The method is accurate， hypersensitized and reproducible， which can be applied to the quality control of Wenyang Zhenshuai Granules.
Key words： Wenyang Zhenshuai Granules； ginsenoside Rg1； ginsenoside Re； ginsenoside Rb1； HPLC
温阳振衰颗粒为湖南省名老中医陈新宇教授临床治疗慢性心力衰竭的经验方，基于现代中医对慢性心力衰竭病机的认识，针对心阳虚衰、瘀血停滞、水饮内停及痰浊不化，组方由人参、茯苓、甘草等7味药组成，具有温阳益气、育阴利尿功效，用于阳虚、水泛型慢性心力衰竭，临床疗效确切[1]。前期药效学研究表明，该方降低基质金属蛋白酶2和9及改善心功能的作用稍优于卡托普利[2]；能上调信号调节激酶5（ERK5）蛋白磷酸化的水平，从而激活ERK5信号转导通路[3]；可通过调节心力衰竭模型兔心脏功能及降低血浆中内皮素-1的含量，以防止和延缓心力衰竭的进一步恶化[4]。笔者采用HPLC对温阳振衰颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1进行含量测定，为控制药品质量和制定质量标准提供参考。
1 儀器与试药
岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20A紫外可见检测器，LabSolutions数据工作站，JH3120型超声波清洗器（荆州市津海化工科技有限公司），HH恒温水浴锅（江苏金达中大仪器厂），AE240电子分析天平（METTLER），TD2102型电子天平（余姚市金诺天平仪器有限公司）。
温阳振衰颗粒样品（8 g/袋，批号20141215、20150109、20150122），湖南中医药大学第一附属医院自制；人参皂苷Rg1对照品（供含量测定用，批号110703-200726）、人参皂苷Re对照品（供含量测定用，批号754-9406）、人参皂苷Rb1对照品（供含量测定用，批号110704-200921），中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2.1 色谱条件
采用Agilent TC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相A为0.05%磷酸、B为乙腈，梯度洗脱程序见表1，检测波长203 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL/min。
2.2 混合对照品溶液的制备
分别取对照品人参皂苷Rg1 13.75 mg、人参皂苷Re 13.75 mg、人参皂苷Rb1 16.25 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，即得人参皂苷Rg1 1.375 mg/mL、人参皂苷Re 1.375 mg/mL、人参皂苷Rb1 1.625 mg/mL的混合对照品贮备液。再精密吸取混合对照品贮备液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得每1 mL含人参皂苷Rg1 0.11 mg、人参皂苷Re 0.11 mg、人参皂苷Rb1 0.13 mg的混合对照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备
取本品，研细，取约2 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷适量，加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞，放置过夜，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，过滤，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
取缺人参的阴性样品适量，研细，取约2 g，精密称定，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备，即得。
2.5 专属性试验
精密吸取对照品溶液、阴性对照溶液及供试品溶液各10 ?L，分别注入高效液相色谱仪中，测定。结果表明，阴性对照溶液在与对照品溶液色谱峰相应位置无相应的色谱峰，说明阴性无干扰。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察
取“2.2”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样2、5、10、15、20 ?L，测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。人参皂苷Rg1 Y=7.7×105X-19 957，r2=0.999 8；人参皂苷Re Y=7.7×105X-17 605，r2=0.999 8；人参皂苷Rb1 Y=4.6×105X+24 235，r2=0.999 1。结果表明，人参皂苷Rg1在0.22～2.2 ?g、人参皂苷Re在0.22～2.2 ?g、人参皂苷Rb1在0.26～2.6 ?g范围内具有良好的线性关系。
2.7 精密度试验
取“2.2”项下混合对照品溶液，精密吸取10 ?L，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积RSD分别为0.61%、1.00%、1.12%，表明该方法精密度良好。
2.8 稳定性试验
取本品内容物，研细，取约2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进样10 ?L，测定峰面积，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积RSD分别为0.69%、0.58%、1.34%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.9 重复性试验
取同一批号样品（批号20141215）的内容物，研细，取6份，每份约2 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定样品含量，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量分别为0.723、0.801、0.570 mg/g，RSD分别为1.02%、1.33%、1.09%，表明本方法重复性好。
2.10 加样回收率试验
精密称取已知含量的温阳振衰颗粒（人参皂苷Rg1 0.703 mg/g、人参皂苷Re 0.818 mg/g、人参皂苷Rb1 0.576 mg/g）共6份，每份2 g，分别准确加入1.375 mg/mL人参皂苷Rg1对照品溶液1 mL、1.375 mg/mL人参皂苷Re对照品溶液1.2 mL、1.625 mg/mL人参皂苷Rb1对照品溶液0.7 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10 ?L注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表2～表4。
2.11 样品测定
取3批温阳振衰颗粒，每批平行做2份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算温阳振衰颗粒样品中3种人参皂苷的含量，结果见表5。
3 讨论
人参为温阳振衰颗粒中的君药，有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、安神益智的功效，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚咳喘等。现代研究表明，人参有较强的抗心律失常[5]、抗休克[6]和心肌细胞保护作用[7-8]。因此，本研究采用HPLC对温阳振衰颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1进行测定，以3种皂苷含量为指标，建立简便、准确、专屬性强的质量控制方法。
本试验考察了Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）和YWG-C18（250 mm×4.6 mm，10 ?m）2个品牌2种长度色谱柱的分离效果，结果表明Agilent TC-C18色谱柱在分离效果和柱压方面都优于YWG-C18柱，故选用Agilent TC-C18色谱柱进行分析。在样品处理方面，分别考察了萃取法、中性氧化铝柱层析法及D101大孔吸附树脂法，结果表明，萃取法对人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的选择性高、专属性好，注入高效液相色谱仪后分离效果好，适合用于含量测定，故选用萃取法进行供试品溶液的制备。在色谱条件方面，分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-水等不同的梯度洗脱流动相，最终选用乙腈-0.05%磷酸进行分离，各被测成分分离良好且峰形较佳。流动相为28%乙腈（35～58 min）时，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re分离度不好，经过对大量条件进行摸索，发现将乙腈19%～28%（35～58 min）梯度调整为乙腈19%～29%（35～58 min），可使部分干扰峰提前出峰，达到含量测定要求。柱温35 ℃时色谱峰的分离度优于30 ℃和25 ℃。
本研究建立的HPLC方法能简便高效地同时对温阳振衰颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1进行检测，经多批供试品验证，重复性好，结果表明该方法可用于温阳振衰颗粒的质量控制。
参考文献：
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[2] 闫红，陈新宇，卢青，等.温阳振衰方对慢性心衰模型大鼠心肌基质金属蛋白酶2，9的影响[J].光明中医，2013，28（7）：1336-1339.
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[6] 于震，韩淑燕，李海霞，等.人參和红花提取物配伍对心肌缺血犬心脏血流动力学的影响[J].中国中医基础医学杂志，2012，18（7）：777-782.
[7] 吴红金，刘宇娜.人参皂甙Rg1抑制60Co照射诱导心肌细胞凋亡[J].医学综述，2008，14（21）：3332-3334.
[8] 吴红金，刘宇娜.人参皂甙Re对60Co照射诱导心肌细胞凋亡的保护作用[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6（8）：923-924.
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更新时间：2024/12/23 6:54:28