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标题 当归及当归多糖对X射线照射致SD大鼠免疫功能损伤的影响
范文 卢志伟++王磊++许小敏++张利英++何进鹏++华君瑞++张艳辉++刘永琦



摘要：目的 探讨当归及当归多糖对X射线照射致SD大鼠免疫功能损伤的防护作用。方法 将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、当归水煎液组、当归多糖组和阳性对照组。常规饲养14 d后，各给药组给予相应药物灌胃，对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每日1次，连续7 d。第8日除对照组外其余各组大鼠进行全身X射线照射，连续2 d，每日1次，每次3 Gy，总吸收剂量为6 Gy。辐射后第3日股动脉采血处死大鼠，血常规检测外周血白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT），有核细胞计数法观察骨髓有核细胞数量，HE染色观察脾脏病理形态，ELISA检测血清干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素（IL）-4的含量。结果 与对照组比较，模型组大鼠脾脏指数、血WBC、骨髓有核细胞数、血清IL-4和IFN-γ含量明显降低（P<0.05），RBC和HGB明显升高（P<0.05）；与模型组比较，各给药组血WBC、骨髓有核细胞数、血清IL-4和IFN-γ含量明显升高（P<0.05），RBC和HGB明显降低（P<0.05）。结论 当归及当归多糖对X射线照射致SD大鼠免疫功能损伤具有保护作用。
关键词：当归；当归多糖；辐射；造血；免疫功能；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0044-05
Effects of Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Sinensis Radix Polysaccharides on Immune Function Injury Induced by X Ray in SD Rats LU Zhi-wei1，2， WANG Lei1， XU Xiao-min1， ZHANG Li-ying1， HE Jin-peng3， HUA Jun-rui3， ZHANG Yan-hui1， LIU Yong-qi1，4 （1. Provincial-Level Key Laboratory for Molecular Medicine of Major Diseases and the Prevention and Treatment with Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Colleges and Universities， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Jiayuguan City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jiayuguan 735100， China； 3. Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， Gansu Key Laboratory of Space Radiobiology， Lanzhou 730000， China； 4. Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China）
Abstract： Objective To investigate the protective effects of Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Sinensis Radix polysaccharides on immune function injury induced by X rays in SD rats. Methods Forty SD rats were randomly divided into control group， model group， Angelicae Sinensis Radix Decoction group， Angelicae Sinensis Radix polysaccharide group and positive medicine group. After routine feeding for 14 day， each administration group was given relevant medicine for gavage， while control group and model group were given the same amount of distilled water for gavage， once a day for 7 d. From the 8th day， except for the control group， the rats in the rest of groups were subjected to whole-body X ray irradiation， continuous exposure to 2 d； the total absorbed dose was 6 Gy. The rats were killed by femoral artery after irradiate 3 d. The WBC count， RBC， HGB， and PLT in peripheral blood
基金項目：国家自然科学基金（81473457）；甘肃省高等学校科研项目（2015A-095）；甘肃中医药大学研究生创新基金（CX2016-16）
通讯作者：刘永琦，E-mail：liuyongqi73@163.com
were observed by blood routine test； the number of nucleated cells in the bone marrow was observed by nucleated cell count method； the pathological changes of spleen were observed by HE staining under microscope； the contents of IFN-γ and IL-4 in serum were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the spleen index WBC， number of bone marrow nucleated cells and serum contents of IL-4 and IFN-γ in model group was significantly lower （P<0.05）， The contents of RBC and HGB increased （P<0.05）. Compared with the model group， WBC， number of bone marrow nucleated cells， and the contents of IL-4 and IFN-γ in serum of each administration group increased significantly （P<0.05）； RBC and HGB decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Angelicae Sinensis Radix and Angelicae Sinensis Radix polysaccharides have protective effects on the immune function injure induced by X ray in SD rats.
Key words： Angelicae Sinensis Radix； Angelicae Sinensis Radix polysaccharide； radiation； hematopoiesis； immune function； rats
目前，随着放射技术在肿瘤诊疗中的广泛应用，增加了患者接触X射线的机会。辐射可以直接或间接作用造成机体的多器官损伤，严重者可诱发细胞突变、癌变及死亡。机体的造血及免疫系统对电离辐射非常敏感，可导致中枢及外周免疫器官功能异常，因此，辐射损伤的防护作用对于保护机体的健康具有非常重要的現实意义。当归的有效成分主要包括当归多糖、当归挥发油、阿魏酸等。现代药理研究表明，当归多糖具有保肝、减毒、抗氧化、提高免疫力、抗肿瘤和抗辐射损伤等作用[1-5]。本实验采用大鼠灌胃当归水煎液及当归的有效成分当归多糖30 min后进行全身X射线照射，探讨当归发挥抗辐射、调节免疫功能的作用是否通过当归多糖起主要作用。
1 材料与方法
1.1 药物及制备
当归用量按临床用量换算成大鼠用量，当归多糖按当归用量同比换算成相对剂量。当归购于甘肃中医药大学附属医院，称取当归饮片20.16 g，剪成0.5 cm大小碎粒，用500 mL双蒸水在不锈钢煎药锅中浸泡30 min。电磁炉煎煮至水开后计时并武火煎煮10 min，之后换文火煎煮30 min，倒出药液，再加250 mL水文火煎煮30 min，倒出药液，合并2次药液，倒入烧杯，微波小火煎煮浓缩至32 mL，此为8只大鼠2 d用量，冷却后置于4 ℃冰箱保存；当归多糖由甘肃中医药大学中药药理与毒理实验室通过水提醇沉法而取得，提取得率2.69%，纯度为66.7%。贞芪扶正颗粒，甘肃扶正药业科技股份有限公司，批号Z62020416。
1.2 主要试剂与仪器
大鼠IL-4（批号ERC002）、IFN-γ（批号ERC101g） ELISA检测试剂盒，深圳欣博盛生物科技有限公司。X射线仪PRECISION X-RAY（美国Faxitron公司），分光光度计（VIS-723N，北京瑞利仪器公司），酶标仪（IMARK，美国Bio-Rad），eppendorf移液器（德国艾本德股份有限公司）。
1.3 动物及处理
SPF级SD雄性大鼠40只，6～8周龄，体质量（200±20）g，第四军医大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（军）2012-0007。饲养于温度（20±2）℃、相对湿度（50±10）%环境，每日光照12 h，自由摄食饮水。常规饲养14 d后，将40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、当归水煎液组、当归多糖组和阳性对照组，每组8只。当归水煎液组按6.3 g/（kg·d）剂量干预，当归多糖组按254.2 mg/（kg·d）剂量干预，阳性对照组按2.625 g/（kg·d）剂量干预，对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，连续1周。第8日起除对照组外其余各组均用X射线仪进行背部照射，总吸收剂量为3 Gy，吸收剂量率为92.26 cGy/min，距辐射源70 cm，辐射后第2日以相同方式进行腹部照射。末次辐射72 h后股动脉取血并处死大鼠检测相应指标，其中末次辐射后第2日模型组大鼠死亡1只，辐射后第3日模型组死亡1只，当归水煎液组和当归多糖组各死亡1只。
1.4 指标检测
1.4.1 一般情况 每日观察大鼠饮食、水量，大鼠精神状态、活动频率、体毛及二便等变化。
1.4.2 脾脏指数 处死大鼠，取出脾脏，将其置于生理盐水冲洗干净，称取脾脏质量，计算大鼠脾脏指数[脾脏质量（mg）÷大鼠质量（g）]。
1.4.3 血常规检测 用含EDTA抗凝管从股动脉取血1 mL，上下晃动抗凝管，使其充分混匀。将全血转入1.5 mL的EP管中，上机检测白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和血小板（PLT）。
1.4.4 骨髓有核细胞 参照文献[6]方法股动脉取血后脱颈处死大鼠，分离大鼠左股骨，用剪刀沿股骨颈将股骨头剪掉，3%冰醋酸10 mL用注射器将骨髓全部冲出，移液器轻轻吹打，将细胞吹散，用血球计数板计数有核细胞数量（4个大格细胞数÷4×10 000）。
1.4.5 脾脏病理形态 脾脏组织切片HE染色，光镜下观察病理变化。
1.4.6 血清白细胞介素-4和γ-干扰素检测 大鼠麻醉后股动脉采血，静置1 h，3000 r/min离心10 min，用微量移液器吸取上清液，于酶标仪波长450 nm处检测各孔吸光度，严格按试剂盒说明书进行操作。
1.5 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析，两两比较用Dunnett-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 一般状况
辐射前各组大鼠饮食、饮水量无差异，活动量正常，体毛光滑。辐射后第1日，各组大鼠饮食明显减少，饮水量明显增加，出现狂躁不安、易惊恐等现象；第2日开始，动物饮食、饮水量均减少，活动频率低，出现精神状态欠佳、蜷卧及弓背耸肩的特殊体态，尤以模型组表现最为显著，实验后期，模型组出现体毛晦黯、光泽度差和脱毛现象，甚至鼻孔出血、腹泻。当归水煎液组和当归多糖组饮食、饮水量增加，精神状态较好，活动增多，大便稀，鼻孔出血减少。
2.2 当归和当归多糖对模型大鼠脾脏指数的影响
与对照组比较，模型组大鼠脾脏指数明显降低（P<0.05）；与模型组比较，各给药组脾脏指数升高，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
注：与对照组比较，*P<0.05
2.3 当归和当归多糖对模型大鼠血常规的影响
与对照组比较，模型组大鼠WBC明显降低、RBC和HGB明显升高（P<0.05）；与模型组比较，各给药组WBC明显升高、RBC和HGB明显降低（P<0.05）。结果见表2。
注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05
2.4 当归和当归多糖对模型大鼠骨髓有核细胞的影响
与对照组比较，模型组大鼠骨髓有核细胞数明显降低（P<0.05）；与模型组比较，各给药组骨髓有核细胞数明显升高（P<0.05）。结果见表3。
2.5 当归和当归多糖对模型大鼠血清白细胞介素-4和干扰素-γ含量的影响
与对照组比较，模型组大鼠血清IL-4、IFN-γ含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，当归水煎液、当归多糖和阳性对照组大鼠血清IL-4和IFN-γ含量明显升高（P<0.05）。结果见表4。
2.6 当归和當归多糖对模型大鼠脾脏病理形态的影响
肉眼：对照组大鼠脾脏被膜完整，表面光滑，红润，质地柔软；模型组大鼠脾脏明显变小，表面出现小结节，颜色黯红，质地较硬；各给药组脾脏体积增大，表面仍有小结节但明显减少，颜色较红润，质地较柔软。镜下：对照组大鼠脾脏被膜完整，红髓和白髓分界清楚，生发中心、边缘区清晰，未见异常，无增生、萎缩及玻璃样变；模型组脾脏脾小体明显萎缩，生发中心不明显，白髓和红髓结构紊乱，脾窦扩张，间质出血严重，存在明显瘀血，淋巴细胞数量明显减少；各给药组脾脏组织病理损伤形态有所改变，脾小体可见，生发中心、红髓和白髓分界可见，未见明显瘀血，炎细胞浸润减轻。结果见图1。
3 讨论
随着辐射剂量的加大，辐射对机体的伤害也愈显著，且体内各系统均会受到不同的损伤，其中尤以造血、免疫、胃肠道及生殖系统的敏感性高。骨髓是机体血细胞与免疫细胞发生和分化的场所，是机体的中枢免疫器官之一。骨髓具有辐射高敏感性，由于骨髓中的WBC、RBC及幼稚细胞均是造血的主要器官，骨髓DNA含量和有核细胞数目在一定程度上能够反映机体造血功能状态，骨髓经辐射后直接表现为骨髓有核细胞数目的减少。
脾脏是体内诱导免疫细胞产生、分化、发育及成熟的主要场所，也是维持机体免疫功能重要的免疫器官之一，因而脾脏指数在某种程度上反映机体免疫功能状态。由于脾脏对辐射高敏感性，脾脏经辐射后脾小体变小或消失，细胞核裂解及相关核质空泡形成、细胞坏死。在机体的免疫系统中，T淋巴细胞辐射敏感性最高。另外，淋巴细胞及其免疫器官（如骨髓、脾脏、胸腺）均具有辐射高敏感性。辐射损伤免疫系统主要表现为免疫细胞数量的减少和免疫器官功能的低下，最终影响机体的特异性免疫应答和非特异性免疫应答。免疫细胞因子主要分为Thl与Th2型细胞因子，其中，Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和肿瘤坏死因子-β等Ⅰ类细胞因子，参与机体细胞免疫，而Th2主要分泌IL-4，参与机体体液免疫。因此，Th1和Th2一旦失衡，必然会引起机体免疫功能的紊乱。相关研究表明，IFN-γ和IL-4在调节机体细胞免疫与体液免疫中发挥重要作用，二者协同调节机体免疫功能状态[7]。本实验结果表明，辐射后大鼠脾脏指数明显降低，机体脾细胞严重损伤；同时，辐射后外周免疫器官与中央免疫器官损伤，外周血WBC明显降低，RBC和HGB升高，大鼠骨髓有核细胞数明显降低。主要机制可能是辐射后，大鼠饮食、水量明显降低，并出现腹泻造成液体大量丢失，从而导致RBC和HGB的升高。辐射对细胞免疫和体液免疫均造成损伤，致使大鼠血清中IL-4和IFN-γ的表达降低。
中医学认为，辐射属于火热毒邪[8]。辐射致机体损伤的机制是热毒过盛、耗气伤津，引起精气血津液的亏虚。当归具有补血活血的功效，临床上主要应用于血液及心血管疾病的治疗。杨铁虹等[9]研究表明，当归多糖能抑制小鼠脾脏萎缩，并能促进小鼠脾细胞和巨噬细胞增殖。张晓君等[10]研究表明，当归多糖能促进小鼠体液免疫，而大剂量使用时能增强细胞免疫，此外，当归多糖能明显增加血虚模型小鼠的外周HGB，同时促进辐射小鼠脾结节与骨髓细胞DNA的合成。本研究结果显示，当提前给予SD大鼠当归水煎液及当归多糖后，能够预防辐射造成外周免疫损伤，使其外周血WBC升高，RBC和HGB降低，减轻辐射引起的脾脏病理损伤，同时对中枢免疫也有预防作用，升高辐射引起的大鼠骨髓有核细胞数降低，同时还能升高辐射大鼠血清IL-4和IFN-γ的含量。
综上所述，当归能够预防辐射引起的SD大鼠免疫功能的损伤，其作用可能是通过有效成分当归多糖实现的。
参考文献：
[1] WANG K， TANG Z， ZHENG Z， et al. Protective effects of Angelica sinensis polysaccharide against hyperglycemia and liver injury in multiple low-dose streptozotocin-induced type 2 diabetic BALB/c mice[J]. Food & Function，2016，7（12）：4889-4897.
[2] 张先平，王乾兴，陈斌，等.当归多糖抑制氧化损伤延缓造血干细胞衰老[J].中国中药杂志，2013，38（3）：407-412.
[3] WANG J， GE B， LI Z， et al. Structural analysis and immunoregulation activity comparison of five polysaccharides from Angelica sinensis[J]. Carbohydrate polymers，2016，140：6-12.
[4] BUNEL V， ANTOINE M， NORTIER J， et al. Potential nephroprotective effects of the Chinese herb Angelica sinensis against cisplatin tubulotoxicity[J]. Pharmaceutical Biology，2015，53（7）：985-994.
[5] CHENG Y， ZHOU J， LI Q， et al. The effects of polysaccharides from the root of Angelica sinensis on tumor growth and iron metabolism in H22-bearing mice[J]. Food & function，2016，7（2）：1033-1039.
[6] 張鹤，张英强，梅建伟.补肾强肝活血法对缺血再灌注大鼠RBC、HGB及骨髓有核细胞计数的影响[J].医学研究杂志，2010，39（10）：33-36.
[7] 贺许良，卢先州，陈枚，等.免疫器官辐射损伤与防护的研究进展[J].现代生物医学进展，2014，14（5）：997-1000.
[8] 高明泽，徐文慧，王天琪，等.急性辐射损伤的中医病因学探讨[J].中医杂志，2016，57（6）：454-457.
[9] 杨铁虹，贾敏，梅其炳.当归多糖对小鼠免疫功能的调节作用[J].中成药，2005，27（5）：563-565.
[10] 张晓君，祝晨蔯，胡黎，等.当归多糖的免疫活性和对造血功能影响[J].中药药理与临床，2002，18（5）：24-25.
（收稿日期：2017-03-07）
（修回日期：2017-03-23；编辑：华强）
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更新时间：2025/3/15 4:59:36