| 标题 | 黄芪多糖对X线辐射骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的影响 |
| 范文 | 王磊+卢志伟+许小敏+刘永琦+张利英+张苡铭+张丽昕+何进鹏+丁楠 摘要：目的 观察黄芪多糖（APS）对X线辐射骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨方向分化的影响，探讨其相关作用机制。方法 采用CCK-8法检测不同浓度APS对2 Gy X线辐射BMSCs细胞增殖能力的影响，以筛选最佳药物浓度。将细胞分为空白组、APS组、辐射组、辐射+APS组。APS组、辐射+APS组用最佳药物浓度APS提前干预3 d，辐射组、辐射+APS组用2 Gy X线进行辐射，辐射后各组细胞均加2 mL成骨诱导液继续培养，每3 d换液1次。诱导15 d后，镜下观察细胞形态，茜素红染色检测细胞中钙结节面积，Western blot检测细胞中特异性标记蛋白骨桥蛋白（OPN）和骨钙蛋白（OCN）的表达。结果 与空白组比较，辐射组细胞增殖水平明显降低（P<0.05）；与辐射组比较，辐射+APS组细胞增殖水平明显升高（P<0.05）；APS浓度为50 μg/mL时其促进增殖作用最强，为最佳药物浓度。形态学观察显示，辐射组细胞中钙结晶沉积较空白组和APS组明显减少，辐射+APS组细胞中钙结晶沉积较辐射组明显增加。在成骨能力方面，与空白组比较，APS组细胞中钙结节面积有一定降低，而辐射组细胞中钙结节面积显著降低（P<0.05）；与辐射组比较，辐射+APS组细胞中钙结节面积明显增多（P<0.05）。在成骨特异性标记蛋白表达方面，与空白组比较，APS组细胞中OPN表达略下降，OCN表达略升高；辐射组细胞中OPN和OCN表達均明显下调（P<0.05）；与辐射组比较，辐射+APS组细胞中OPN和OCN表达均显著升高（P<0.05）。结论 黄芪多糖对X线辐射BMSCs向成骨方向分化的潜能具有保护作用。 关键词：黄芪多糖；X线辐射；骨髓间充质干细胞；成骨分化 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.012 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0047-05 Effects of Astragalus Polysaccharide on Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells Induced by X-ray Radiation WANG Lei1， LU Zhi-wei1， XU Xiao-min1， LIU Yong-qi1，2， ZHANG Li-ying1， ZHANG Yi-ming1， ZHANG Li-xin1， HE Jin-peng3， DING Nan3 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Major Disease Prevention and Control of Molecular Medicine and Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Provincial Key Laboratory， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China； 3. Gansu Key Laboratory of Space Radiobiology， Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000， China） Abstract： Objective To investigate the effects of astragalus polysaccharide （APS） on bone mesenchymal stem cells （BMSCs） to osteoblasts differentiation induced by X-rays； To discuss its mechanism of action. Methods CCK-8 method was used to select different concentrations of APS for the proliferation ability of BMSCs with 2 Gy X-ray radiation， and the best concentration was determined. Cells were divided into blank group， APS group， radiation group， radiation+APS group. APS group and radiation+APS group were given the best concentration of APS for 3 days， radiation group and radiation+APS group were given 2 Gy X-ray radiation. After radiation， 2 mL osteogenesis induced liquid was added in each group， every 3 day. After 15 days induction， inverting microscope was used to 基金项目：国家自然科学基金（81473457） 通讯作者：刘永琦，E-mail：liuyongqi173@163.com observe morphology， and alizarin red staining to detect the area of the calcium nodules in each group. Western blot was used to detect the specific marker protein osteopontin and osteocalcin expression of each group. Results Compared with the blank group， the proliferation ability of radiation group was obviously lower （P<0.05）； compared with radiation group， the proliferation ability of radiation+APS significantly increased （P<0.05）； the strongest promoting proliferation of APS was 50μg/mL， therefore， it was selected as the best concentration. In terms of morphology， inverted microscope showed that secretion of crystals of radiation group was obviously reduced compared with the blank group and APS group， and secretion of crystals of radiation+APS group was significantly elevated compared with radiation group. In osteogenesis ability， compared with the blank group， the cell calcium nodule area of APS group had a certain reduce， but the radiation group had a significantly reduced （P<0.05）. Compared with the radiation group， the cell calcium nodule area of radiation+APS group obviously increased （P<0.05）. In terms of osteogenesis specific marker protein expression， compared with the blank group， the expression of osteopontin of APS group was slightly declined， and the expression of osteocalcin was slightly elevated， but the expression of osteopontin and osteocalcin of radiation group was significantly lowered （P<0.05）. Compared with the radiation group， the expression of osteopontin and osteocalcin of radiation+APS group was significantly higher （P<0.05）. Conclusion APS has protective effects on osteoblastic differentiation ablility of BMSCs induced by X-ray radiation. Key words： astragalus polysaccharide； X-ray radiation； BMSCs； osteoblasts differentiation 骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）属多能干细胞的一种，其具有向骨、脂肪、神经、内皮等多方向分化的潜能，常将BMSCs用于治疗骨病、心血管疾病、组织退化、炎症，甚至肿瘤等[1-3]。目前，BMSCs已作为组织损伤修复的理想种子细胞而广泛应用于临床[4]。随着辐射医学在临床诊治中的普遍应用，BMSCs受到电离辐射后是否影响其分化潜能尚未有系统的研究报道。黄芪乃益气扶正的代表药，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效，现代研究认为，黄芪的主要药效成分黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）具有抗辐射、抗氧化、减轻放疗不良反应等作用[5]。本实验观察APS对辐射损伤后BMSCs向成骨方向分化的影响，为BMSCs在临床上应用提供依据。 1 实验材料 1.1 细胞和药物 BMSCs（广州赛业），细胞培养液为BMSCs专用培养基（广州赛业）。APS（上海源叶生物，批号ZD1219LA13），用BMSCs专用培养基溶解，浓度为50 μg/mL。细胞用60 mm培养皿，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养，每3 d换液1次，待细胞融合度达到85%时，0.25%胰蛋白酶消化传代，第5代细胞用于实验。 1.2 主要试剂和仪器 0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司），CCK-8试剂盒（上海东仁公司），成骨诱导液（广州赛业），骨钙蛋白（OCN）抗体（Proteintech），骨桥蛋白（OPN）抗体和GAPDH抗体（Abcam），山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记和山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶标记（北京中杉金桥），茜素红染液（广州赛业）。恒温培养箱（美国Thermo公司），X-ray仪（美国Faxitron公司），全波长酶标仪（瑞士TECAN公司），倒置显微镜（奥林巴斯）。 1.3 照射条件和分组 X线辐射装置由中国科学院近代物理研究所提供，剂量率为0.4 Gy/min（100 keV，5 mA），总剂量2 Gy，时间5 min，距辐射源高度为70 cm，实验分为空白组、APS组、辐射组、辐射+APS组。 2 实验方法 2.1 CCK-8法检测 细胞培养达85%融合度时，胰酶消化制成单细胞悬液，分别接种于5个96孔板（每孔2×103/100 μL），待细胞贴壁后加不同浓度（0、12.5、25、50、100 μg/mL）的APS 100 μL，每个浓度设6个复孔，培养3 d后，每孔弃掉50 μL培养基，空白组复孔用0.3 mm厚的铅板挡住，其余孔用2 Gy X线进行照射，照射后弃剩余培养基，重新加入100 μL BMSCs專用培养基。置于培养箱中继续培养，分别于1～5 d用CCK-8法检测各组细胞增殖。 2.2 细胞形态观察 BMSCs培养至85%融合度后，胰酶消化，稀释至1×105/mL，取1 mL稀释液接种于35 mm培养皿中，继续培养。待细胞贴壁后，弃培养基，APS组、辐射+APS组均加50 μg/mL的APS培养液2 mL，空白组、辐射组加等体积培养液代替。各组细胞置于培养箱中继续培养3 d后，辐射组、辐射+APS组用2 Gy X线照射，照射后弃所有细胞培养基，加入成骨诱导液2 mL，置于培养箱中继续培养，每3 d换液1次，诱导15 d后，镜下观察细胞形态。 2.3 茜素红染色 显微镜观察各组细胞形态后，弃培养基，PBS洗2次，然后加入4%多聚甲醛1 mL固定20 min，PBS洗2次，加1 mL茜素红染色，室温静置10 min，弃染色液，PBS洗2次，每次10 s，镜下观察染色情况并拍照。用Image Pro软件对钙结节面积进行分析，每组选取6张图，计算各组钙结节平均面积。 2.4 Western blot检测 提取各组细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，用RIPA调整蛋白浓度。各组取5 μL蛋白上样，经5%浓缩胶、12%分离胶电泳后，转PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，4 ℃冷库一抗（1∶1000）孵育过夜，PBS洗3次，每次10 min，分别与山羊抗兔和山羊抗小鼠辣根酶标记的二抗（1∶4000）孵育，ECL发光显色后，X曝光机显影，并用扫描仪扫描相应的蛋白条带，最后用Image J软件对条带进行灰度分析，以GAPDH作内参，计算各组细胞蛋白的相对表达量。 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P <0.05表示差异有统计学意义。 4 结果 4.1 不同浓度黄芪多糖对辐射后骨髓间充质干细增殖的影响 与空白组比较，辐射组BMSCs细胞增殖水平显著降低（P<0.05）；与辐射组比较，12.5 ?g/mL APS第4、5日促进BMSCs细胞增殖（P<0.05），25 ?g/mL APS在第3～5日促进BMSCs细胞增殖（P<0.05），50、100 ?g/mL APS第1～5日促进BMSCs细胞增殖（P<0.05）。50 ?g/mL APS时，细胞OD值最大，故选50 ?g/mL作为最佳药物浓度。结果见表1。 5 讨论 BMSCs来源于胚胎早期的中胚层，是一种具有强大分化潜能的多能干细胞，可向成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经细胞、脂肪细胞等方向分化，并且具有较低的免疫排斥反应[6]，因此，BMSCs被作为组织修复和重建的理想种子细胞广泛应用于临床上。 在分化过程中，表型特异转录因子的激活决定着BMSCs分化的方向[7]，而成骨细胞特异性转录因子2（RUNX2）作为成骨细胞的特异转录因子，对骨组织的形成和重建起着重要作用，而其调控的功能蛋白OPN、OCN的表达水平标志着细胞成骨分化的能力[8]。OPN属Sibling蛋白家族成员，是一种分泌型的磷酸化糖蛋白，是成骨细胞旁分泌因子的一种，在成骨细胞分化的早期即开始表达，在成熟的成骨细胞和破骨细胞中高水平表达，是成骨细胞在基质形成和成熟阶段的特征性标志物[9]。OCN则与骨的形成和吸收相关，可以促进骨的钙化，是成骨细胞成熟的标志，其表达在成骨细胞钙化期开始，并随着钙化时间的延长而达到峰值[10]。因此，OPN和OCN能够共同反映BMSCs成骨分化的能力。 本实验结果显示，经辐射后，BMSCs成骨分化能力明显受到抑制，表现为诱导后BMSCs钙结晶沉积较空白组和APS组明显减少；而提前给予50 ?g/mL APS干预后，BMSCs分化为成骨细胞的能力得到明显保护，表现为诱导后BMSCs钙结晶沉积较空白组明显增加。茜素红染色结果显示，提前给予50 ?g/mL APS干预BMSCs，能达到防护辐射对BMSCs成骨分化能力损伤的作用，这与周妮娜等[11]研究报道对电离辐射造成的细胞DNA损伤具有保护作用是一致的。 APS是黄芪主要的药效成分之一。现代药理研究表明，APS对辐射损伤具有保护作用，尚能促进BMSCs的分化能力[12-13]。本研究采用CCK-8法筛选APS最佳药物浓度后，将其作用于2 Gy X线辐射的BMSCs细胞。结果显示，辐射后BMSCs分化为成骨细胞的潜能明显受到抑制，表现为成骨诱导后钙结晶沉积和钙结节面积减少，成骨特异性标记蛋白OPN、OCN表达下调；而提前给予50 ?g/mL APS干预3 d后，BMSCs成骨分化潜能得到保护，表现为成骨诱导后钙结晶沉积和钙结节面积相对增加，成骨特异性标记蛋白OPN、OCN表达相对上调。 综上所述，BMSCs受到X线辐射后，其向成骨细胞分化的潜能被明显抑制。而提前给予50 ?g/mL APS干预3 d后，BMSCs向成骨细胞分化的潜能得到保护。 参考文献： [1] ZHANG Y， XIA X， YAN J， et al. 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