| 标题 | 针刺对血管性痴呆大鼠前额叶皮层炎症水平的影响 |
| 范文 | 杨静雯 林丽婷 李天然 摘要：目的 觀察针刺对血管性痴呆大鼠前额叶皮层Toll样受体4（TLR4）表达及下游炎症因子白细胞介素（IL）-1β和IL-6表达的影响，探讨针刺的脑保护作用。方法 50只大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组和非穴组。采用双侧颈总动脉永久性结扎方法制作血管性痴呆大鼠模型。造模后第3日针刺干预，每日1次，共2周。采用Morris水迷宫实验评价大鼠空间学习记忆能力，免疫组化检测小胶质细胞标志物离子钙结合蛋白1（Iba1）及TLR4表达，RT-PCR检测炎症因子IL-1β和IL-6的mRNA表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠空间学习记忆能力降低，前额叶皮层Iba1、TLR4及IL-1β、IL-6表达升高；与模型组比较，针刺组大鼠空间学习记忆能力改善，前额叶皮层Iba1、TLR4及IL-1β、IL-6表达降低；非穴组无明显改善。结论 针刺可抑制血管性痴呆大鼠前额叶皮质小胶质细胞激活，降低TLR4及其下游炎症因子表达水平，改善大鼠空间学习记忆能力。 关键词：血管性痴呆；针刺；小胶质细胞；Toll样受体4；炎症反应；大鼠 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.012 中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）06-0048-05 Effects of Acupuncture on Inflammation in Prefrontal Cortex of Vascular Dementia Rats YANG Jing-wen1， LIN Li-ting1， LI Tian-ran1， ZHANG Shuai1， WANG Xue-rui1， LIU Cun-zhi2 1. Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China； 2. Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on TLR4， inflammation factors IL-1β and IL-6 expressions in the prefrontal cortex of vascular dementia （VD） rats； To investigate the brain protective mechanisms of acupuncture. Methods A total of 50 rats were randomly divided into sham-operation group， model group， acupuncture group， and placebo-acupuncture group. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion （2VO） in rats. Acupuncture was performed at three days after surgery， once daily for two weeks. Morris water maze was used to test the cognitive function. The expressions of Iba1 and TLR4 were assessed by immunohistochemical method. Inflammation factors IL-1β and IL-6 mRNA expressions were tested by RT-PCR. Results Compared with sham-operation group， the model group rats showed impaired spatial learning and memory ability， and expression of Iba1， TLR4， and IL-1β， IL-6 increased. Compared with the model group， the spatial learning and memory abilities of the acupuncture group were improved， and the expression of Iba1， TLR4 and IL-1β， IL-6 in the prefrontal cortex decreased. These effects were not found in the placebo-acupuncture group. Conclusion The effect of acupuncture may be achieved by inhibiting microglia activate， decreasing the expressions of TLR4， IL-1β and IL-6 in the prefrontal cortex， resulting in improving spatial learning and memory ability of VD rats. Keywords： vascular dementia； acupuncture； microgila； TLR4； inflammation； rats 血管性痴呆（vascular dementia，VD）是指各种脑血管疾病引起的大脑功能障碍而产生的一种慢性进行性获得性认知功能损害综合征。研究表明，炎症反应在慢性脑缺血后继发性神经损伤中起重要作用[1-2]。小胶质细胞是中枢神经系统中炎症发生的主要细胞，在免疫应答过程中起关键作用。Toll样受体（TLRs）是一组典型的内源性免疫反应的识别受体，国外研究显示，TLRs家族参与了神经炎症及痴呆的进程，Toll样受体4（TLR4）介导了脑缺血炎性损伤[3]。近年來研究表明，针刺对VD有神经保护作用[4-7]。有报道，针刺可通过抑制脑缺血后的炎症反应，调控炎性介质释放，发挥神经保护作用[8]。本实验观察针刺对VD大鼠前额叶皮层TLR4表达及下游炎症因子白细胞介素（IL）-1β和IL-6水平的影响，探讨针刺的脑保护作用。 1 实验材料 1.1 动物 10周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠50只，体质量300～320 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。饲养于恒温（25±1）℃、相对湿度40%～60%环境，适应性饲养3 d。整个实验过程符合动物伦理学标准。 1.2 主要试剂与仪器 PageRuler（美国Haoranbio公司），封闭用山羊血清（北京康为世纪公司），兔抗鼠Iba1一抗（美国Millipore公司），兔抗鼠TLR4一抗（美国Millipore公司），二步法抗兔/鼠通用型二抗试剂盒（上海基因科技有限公司），DAB显色剂（北京中杉金桥公司），炎症因子及β-actin mRNA引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。Morris水迷宫（美国CSI公司），离心机（美国Beckma公司），电子天平（美国sart & rius公司），冰冻切片机（德国Leica公司），BX51型光学显微镜（日本Olympus公司），RG-3000荧光定量PCR仪（澳大利亚Corbett Research公司），华佗牌0.30 mm×25 mm一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。 2 实验方法 2.1 造模 采用双血管阻断方法复制VD模型[9]。2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，麻醉后切开颈部正中皮肤，剥离肌肉，充分暴露双侧颈总动脉，将血管与迷走神经用器械仔细分离，5-0丝线将双侧颈总动脉双重丝线永久性结扎。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外其他操作同手术组。造模后大鼠死亡10只，将造模成功大鼠随机分为模型组、针刺组和非穴组，每组10只。 2.2 干预 造模后第3日开始针刺治疗。取穴参照动物穴位图谱[10]。取“百会”、双侧“足三里”，行捻转补法（捻转角度<90°，频率>120次/min，持续30 s）。非穴组选取双侧肋下髂嵴上10 mm作为对照刺激点，行平补平泻法（捻转角度90～180°，每分钟60～120次，持续45 s）。每日1次，治疗6 d，休息1 d，共治疗12次。假手术组和模型组分别行与针刺组和非穴组相同时间、相同程度的捉抓刺激。 2.3 Morris水迷宫实验 水迷宫直径160 cm，高 40 cm，水深30 cm，水温（23±1）℃，池壁上4个等距离点分水池为4个象限，任选一象限在其中央放置平台。平台无色透明，直径10 cm，平台没于水面下2 cm，水池周围放置的参照物保持不变。测试5 d，每日4次。实验时，操作者将大鼠随机从4个不同象限放入水中，记录大鼠游泳速度和逃避潜伏期。若60 s大鼠仍未找到平台，则将大鼠放置在平台上停留10 s，逃避潜伏期记录为60 s。实验第6日撤除平台，观察60 s内大鼠在池中平台所在象限的时间。 2.4 取材及处理 末次针刺后第2日，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，大鼠麻醉后断头快速取出脑组织，分离前额叶皮层，-80 ℃冰箱保存。 2.5 RT-PCR检测白细胞介素-1β、白细胞介素-6 mRNA表达 大鼠前额叶皮层组织用Trizol提取总RNA，用无RNA酶的DNA酶消化DNA杂质，紫外分光光度计测RNA OD260/280比值，检测RNA纯度。反转录合成cDNA，反应条件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min终止反应。扩增反应条件：95 ℃预变性2 min 后，变性（95 ℃ 10 s）、退火（60 ℃ 30 s）、延伸（70 ℃ 30 s）共40个循环，从70 ℃→95 ℃ 范围内收集荧光信号，共10 min，得到融解曲线。以β-actin基因表达量作为RT-PCR产物的内参照，以Rotor-Gene6.0软件收集循环阈值（Ct值，即每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所需要循环数），目的基因相对mRNA表达用以下公式进行计算：目的基因相对mRNA表达=2-ΔΔCt，ΔCt=待测基因Ct值-管家基因Ct值。引物序列见表1。 2.6 免疫组化检测离子钙结合蛋白1、Toll样受体4表达 室温0.3%TritonX-100通透20 min，3%H2O2孵育20 min，滴加山羊血清封闭液，37 ℃孵育30 min，滴加一抗（1∶50），4 ℃过夜，滴加二抗，37 ℃孵育120 min。上述步骤间除羊血清外均用PBS洗3次，每次5 min。使用DAB显色试剂盒室温显色，洗涤后苏木素溶液复染，脱水封片。 3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析，组间多重比较方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett's T3。P<0.05表示差异有统计学意义。 4 结果 4.1 针刺对模型大鼠学习记忆能力的影响 与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长，平台所在象限时间显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，针刺组大鼠逃避潜伏期显著缩短，平台所在象限时间显著延长，差异有统计学意义（P<0.05），非穴组未见明显差异；针刺组大鼠逃避潜伏期较非穴组显著缩短，差异有统计学意义（P<0.05），针刺组大鼠平台所在象限时间较非穴组显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图1、图2。 4.2 针刺对模型大鼠前额叶皮层小胶质细胞的影响 与假手术组比较，模型组大鼠前额叶皮层小胶质细胞标记物离子钙结合蛋白1（Iba1）阳性细胞数显著增多（P<0.001）；与模型组比较，针刺组大鼠前额叶皮层Iba1阳性细胞数显著减少，差异有统计学意义（P<0.01）；与非穴组比较，针刺组鼠前额叶皮层Iba1阳性细胞数显著减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图3。 4.3 针刺对模型大鼠前额叶皮层Toll样受体4表达的影响 TLR4免疫组化染色阳性表达产物呈棕黄色。与假手术组比较，模型组大鼠前额叶皮层TLR4着色较深，阳性细胞数显著升高（P<0.01）；与模型组比较，针刺组大鼠前额叶皮层TLR4阳性细胞数显著降低（P<0.01）；与非穴组比较，针刺组大鼠前额叶皮层TLR4表达显著降低（P<0.01）。结果见图4。 4.4 针刺对模型大鼠前额叶皮层炎症因子表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠前额叶皮层炎症因子IL-1β和IL-6 mRNA表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，针刺组大鼠前额叶皮层IL-1β和IL-6 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与非穴组比较，针刺组大鼠前额叶皮层炎症因子IL-1β和IL-6 mRNA表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图5、图6。 5 讨论 目前，VD早期治疗具有可逆性[11]。因此，研究其发病机制，寻找行之有效的治疗方法是亟待解决的问题。脑血管病的病灶波及前额叶皮层，导致脑内炎症反应的发生，继而引起神经元损伤，使学习、记忆功能减退可能是VD的发病机制。本研究发现，针刺能抑制小胶质细胞激活，减少TLR4表达，降低大脑前额叶皮层炎症水平，改善神经元损伤，从而提高VD大鼠学习记忆能力。 VD属中医学“呆症”范畴，病位在脑，基本病机是肝肾精血不足，髓海空虚，痰瘀痹阻，神机失用。结合经络理论，《难经·二十八难》云：“督脉者……上至风府，入属于脑。”故针刺百会可提督醒脑。足三里属足阳明胃经，脾胃为气血生化之源，能够运化营养物质营养全身及脑，有助于记忆的改善。本课题组前期研究发现，“足三里”“百会”作为VD动物研究中最常用的穴位，对改善VD大鼠学习记忆能力效果最显著[5，12]。 海马是与人类的学习记忆等高级功能有密切关系的重要功能区，对缺血低灌注损伤有易感性，被认为是与VD大鼠认知损害相关的主要脑区，但与认知功能密切相关的前额叶皮层在神经退行性疾病的病理过程中也有着潜在作用[13]。有研究显示，针刺能改善大鼠海马炎症反應，发挥神经保护作用[14]，但是针刺对前额叶皮层的相关研究较少。 脑缺血后小胶质细胞介导的炎症反应参与了VD的发生与发展。TLR4主要表达于小胶质细胞，可被多种内源性或外源性因子所激活，通过进一步激活下游的信号通路，参与小胶质细胞介导的神经炎症反应[15]。目前的研究发现，TLR4依赖的小胶质细胞激活参与了多种神经免疫疾病及退行性疾病的慢性炎症过程[16-17]。此外，近年研究发现，TLR4所介导的炎症反应还参与了脑缺血性疾病的发生。Gao Y等[3]研究表明，TLR4可诱导中枢神经损伤，介导脑缺血炎性损伤。李莹等[18]研究发现，TLR4 mRNA表达增加可能刺激肿瘤坏死因子-α（TNF-α）产生、分泌增多，从而参与介导脑梗死炎性损伤。本研究发现，针刺可通过抑制TLR4表达，缓解慢性脑低灌注导致的炎症反应。 TLR4激活下游信号通路，导致一系列炎症因子表达升高，促使白细胞趋化至损伤部位，引起神经元损伤，使动物的学习、记忆功能减退。Campbell I L等[19]研究发现，脑内高水平的IL-6可导致转基因小鼠神经元退化并影响学习和记忆。陈秋欣等[20]研究发现，针刺可降低血清及血肿组织中TNF-α、IL-6的含量，减轻脑出血后继发性损伤。本研究发现，针刺可降低VD大鼠大脑皮层炎症因子IL-1β、IL-6的mRNA表达，从而改善大鼠学习记忆能力。 综上，本研究以双血管阻断法建立的VD大鼠模型为研究对象，初步探讨了针刺改善VD认知损害的炎症机制。本研究结果从行为学观察、炎症调节因子TLR4表达及下游炎症因子IL-1β、IL-6的mRNA表达3个方面，共同说明针刺“足三里”“百会”可抑制大脑前额叶皮层TLR4表达，降低炎症因子IL-1β、IL-6的含量，从而改善VD大鼠的学习记忆能力，从机制上阐明针刺改善VD认知损害的可能靶点，为探讨针刺治疗VD提供了一定的依据。 参考文献： [1] WERSCHING H， DUNING T， LOHMANN H， et al. 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