| 标题 | 忍冬藤饮片标准煎液质量评价研究 |
| 范文 | 范帅帅 田伟 王相 冯玉 李军山 牛丽颖 摘要：目的 制备忍冬藤饮片标准煎液，并建立其质量控制方法。方法 按照标准煎液制备要求制备15批忍冬藤饮片标准煎液，以绿原酸、咖啡酸、马钱苷作为定量检测指标，计算出膏率、含量和转移率，并建立超高液相色谱特征图谱分析方法。结果 15批忍冬藤饮片标准煎液的出膏率范围为6.44%～11.95%，绿原酸、咖啡酸、马钱苷含量范围分别为12.17～22.61 mg/g、2.75～5.12 mg/g、21.71～40.32 mg/g，转移率范围分别为28.13%～52.25%、53.93%～100.15%、40.04%～74.36%。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行分析和相似度评价，标定了10个共有特征峰，并指认绿原酸、咖啡酸、马钱苷3个色谱峰。通过与对照图谱比对，相似度均高于0.96。结论 本研究建立的忍冬藤饮片标准煎液的质量评价方法准确、稳定、重复性良好，可为忍冬藤配方颗粒的质量控制提供参考。 关键词：忍冬藤；饮片；标准煎液；配方颗粒；转移率；出膏率；含量测定；特征图谱 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）03-0082-06 Abstract： Objective To prepare standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces； To establish quality control method. Methods Fifteen batches of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces were prepared according to the standardization method. With chlorogenic acid， caffeic acid and loganin as the detection indices， the extraction rate， content， and transfer rate were calculated and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Results According to the measurement of 15 batches of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces， the extractum rate was at the range of 6.44%–11.95%. The contents of chlorogenic acid， caffeic acid and loganin were 12.17–22.61 mg/g， 2.75–5.12 mg/g and 21.71–40.32 mg/g， respectively. The transfer rates were 28.13%–52.25%， 53.93%–100.15% and 40.04%–74.36%， respectively. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms. Ten common peaks were determined， and three chromatographic peaks of chlorogenic acid， caffeic acid， and loganin were identified. The similarity was over 0.96 by comparing with the control map. Conclusion This study establishes the quality control method of standard decoction of Lonicerae Japonicae Caulis decoction pieces， which is accurate， stable， and with good repeatability， which can provide references for the quality control of Lonicerae Japonicae Caulis formula granules. Keywords： Lonicerae Japonicae Caulis； decoction pieces； standard decoction； formula granules； transfer rate； extractum rate； content determination； characteristic chromatogram 忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝[1]。始载于陶弘景《名医别录》：“今处处皆有，似藤生，凌冬不凋，故名忍冬。”忍冬藤有清热解毒、疏风通络的功效。忍冬藤在我国大部分地区有分布，很多地方已有栽培，其中以河南、山东的产量最大。研究表明，忍冬藤主要活性成分为有机酸类和环烯醚萜苷类[2-3]。绿原酸和咖啡酸具有一定的抗菌、抗感染作用[4]，在忍冬藤中含量较高，为其主要活性成分[5]；马钱苷具有抗炎及调节免疫功能的作用[5]。三者的药理活性能够体现忍冬藤的功效。因此，以绿原酸、咖啡酸、马钱苷为指标成分测定其含量，能更好地整体评价忍冬藤的内在质量。 标准煎液的制备遵循传统煎液的煎煮原则，对工艺流程要求规范化和标准化，保证临床用药的准确性[6]。因此，本研究以水为溶媒，采用煎煮方式制备15批忍冬藤饮片标准煎液，对忍冬藤有效成分进行提取，通过测定绿原酸、咖啡酸、马钱苷3个主要活性成分的含量、转移率和出膏率的范围，并以特征图谱为主的整体质量控制方法建立15批忍冬藤标准煎液的UPLC特征图谱，评价忍冬藤标准煎液的内在质量，为忍冬藤配方颗粒的质量控制和源于忍冬藤水煎液的制剂质量控制提供数据参考。 1 仪器与试药 ACQUITY UPLC H-Class系统（PDA检测器），美国沃特世公司；Empower3色譜工作站，美国沃特世公司；LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱），日本岛津公司；Pilot5-8L真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；TB-215D、BSA224S-CW电子分析天平，北京赛多利斯；JY10001型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司；KQ-250型超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司；RE-3000型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；BJH-W200F型陶瓷自动中药煲（电源220 V、50 Hz，功率300 W，容量2.0 L），广东天际电器股份有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。 绿原酸对照品（批号PY20170216，纯度≥99%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸对照品（批号110885-200102，纯度≥99%），中国食品药品检定研究院；马钱苷对照品（批号MUST-16080704，纯度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；乙腈（Fisher化学试剂公司）、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。15批不同产地忍冬藤饮片均由神威药业集团有限公司提供，经河北省药品检验院孙宝惠主任药师鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，样品来源见表1。 2 方法与结果 2.1 标准煎液的制备 取忍冬藤饮片100 g，使用煎药壶煎煮2次。一煎加水10倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min；二煎加水8倍，武火沸腾，文火保持微沸15 min。趁热用200目筛网分离煎液，煎液迅速放入冷水浴中冷却，合并2次煎液。60 ℃真空减压浓缩至密度为1.00～1.02 g/mL，使用密度计和pH计测定流浸膏的密度和pH值，放入冰柜冷冻（-40 ℃）过夜，用冷冻干燥机干燥，得标准煎液干膏粉，计算出膏率。出膏率（%）=冻干粉质量÷饮片质量×100%，按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0800水分测定法第二法（烘干法）测定水分。结果见表2。以均值上下浮动30%来规定出膏率，15批忍冬藤饮片标准煎液出膏率为6.44%～11.95%。 2.2 绿原酸、咖啡酸和马钱苷含量测定 2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相A为0.3%磷酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0～30 min，7%B；30～32 min，7%→10%B；32～50 min，10%B；50～51 min，10%→90%B；51～57 min，90%B；57～58 min，90%→7%B；58～65 min，7%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：马钱苷236 nm，绿原酸、咖啡酸327 nm；进样量：5 ?L；柱温：35 ℃。色谱图见图1。 2.2.2 对照品溶液的制备 取绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含34.6 ?g绿原酸、6.1 ?g咖啡酸和67.9 ?g马钱苷的混合对照品溶液，即得。 2.2.3 供试品溶液的制备 取本品干膏粉适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得忍冬藤标准煎液供试品溶液；取15批饮片粉末各约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得忍冬藤饮片供试品溶液。 2.2.4 方法学考察 2.2.4.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液4、6、8、10、12、14 ?L，按上述色谱条件测定，以绿原酸进样量为横坐标，测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明绿原酸在0.138～0.484 ?g范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1.991×106X+3.348×104，r=0.999 8；以咖啡酸进样量为横坐标，测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明咖啡酸在0.024～0.085 ?g范围内线性关系良好，回归方程为：Y=4.400×106X+1.419×104，r=0.999 7；以马钱苷进样量为横坐标，测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明马钱苷在0.271～0.950 ?g范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1.433×106X+5.419×104，r=0.999 6。 2.2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液5 ?L，按上述色谱条件连续进样6次，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积的RSD分别为1.04%、1.52%、1.19%，均小于2%，表明仪器精密度良好。 2.2.4.3 稳定性试验 精密称取标准煎液干膏粉约0.1 g，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取供试品溶液5 ?L，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10 h进样测定，绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积RSD分别为1.85%、1.68%、1.08%，结果表明，供试品溶液中绿原酸、咖啡酸、马钱苷在10 h内稳定。 2.2.4.4 重复性考察 精密称取同一批样品6份，每份约0.1 g，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液5 ?L，按上述色谱条件进样，计算得供试品溶液绿原酸、咖啡酸、马钱苷总含量RSD=0.80%，结果表明，该方法重复性良好。 2.2.4.5 加样回收率试验 取同一批样品9份，研细，每份约0.05 g，精密称定。精密加入一定体积的绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品贮备液，按供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定，每份平行测定3次，结果表明该方法准确度良好，见表3。 2.2.5 样品含量测定 采用上述方法测定15批忍冬藤饮片和标准煎液中绿原酸、咖啡酸、马钱苷的含量，计算转移率。结果见表4。以均值上下浮动30%规定绿原酸、咖啡酸、马钱苷的含量和转移率的变化范围，绿原酸、咖啡酸、马钱苷含量范围分别为12.17～22.61 mg/g、2.75～5.12 mg/g、21.71～40.32 mg/g，转移率范围分别为28.13%～52.25%、53.93%～100.15%、40.04%～74.36%。 2.3 特征图谱 2.3.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）；流动相A为0.1%磷酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0～4.5 min，95%→92%B；4.5～6 min，92%→91%B；6～8 min，91%→90%B；8～9 min，90%→89%B；9～12 min，89%B；12～12.1 min，89%→95%B；12.1～20 min，95%B）；流速0.3 mL/min；检测波长238 nm；柱温30 ℃；样品室温度8 ℃；进样量1 ?L。 2.3.2 对照品溶液制备 取绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品适量，精密称定，加甲醇配制成每1 mL含34.6 ?g绿原酸、6.1 ?g咖啡酸和67.9 ?g马钱苷的混合对照品溶液，即得。选择马钱苷峰作为参照峰。 2.3.3 供试品溶液的制备 取干膏粉约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声（功率250 W，频率35 kHz）10 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。 表4 忍冬藤饮片和标准煎液中绿原酸、咖啡酸、马钱苷含量及转移率测定结果 编号 标准煎液含量/（mg/g） 饮片含量/（mg/g） 转移率/% 绿原酸 咖啡酸 马钱苷 绿原酸 咖啡酸 马钱苷 绿原酸 咖啡酸 马钱苷 S1 14.12 4.37 21.78 2.80 0.59 2.84 45.88 67.25 69.73 S2 13.60 4.23 21.12 3.17 0.52 3.87 43.34 82.87 55.10 S3 14.16 4.89 20.59 2.95 0.61 3.44 46.05 77.40 57.47 S4 11.24 3.10 29.72 2.98 0.39 5.18 32.45 67.62 49.34 S5 12.57 3.31 32.05 3.05 0.40 5.40 34.23 68.38 49.28 S6 14.01 4.05 34.96 2.99 0.50 5.73 44.10 76.75 57.33 S7 13.26 3.96 33.54 2.93 0.51 5.90 41.59 71.88 52.26 S8 12.88 4.02 32.03 3.16 0.48 5.54 38.70 80.13 54.95 S9 12.64 3.30 30.09 3.18 0.49 5.44 34.19 57.74 47.58 S10 27.85 4.07 36.32 7.25 0.43 6.19 34.55 84.28 52.79 S11 15.07 3.98 27.52 4.03 0.51 4.87 30.26 63.14 45.77 S12 33.74 3.90 40.49 8.19 0.43 6.36 42.45 92.82 65.58 S13 22.75 3.82 39.89 5.12 0.45 6.00 45.29 86.42 67.81 S14 22.52 4.37 35.98 4.83 0.44 4.87 37.73 80.15 59.80 S15 20.42 3.66 29.14 3.84 0.36 3.90 52.07 98.77 73.26 2.3.4 方法學考察 2.3.4.1 精密度试验 精密吸取同一份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。 2.3.4.2 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别于制备后0、4、6、8、10、14 h进样，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明供试品溶液在14 h内稳定性良好。 2.3.4.3 重复性试验 精密称取同一批干膏粉样品6份，按供试品溶液制备方法制备，精密吸取供试品溶液1 ?L，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。 2.3.5 特征图谱的建立 分别制备15批忍冬藤饮片、标准煎液的供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录15 min色谱图，将所得色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，采用多点校正将谱峰自动匹配，中位数法计算得样品特征图谱的共有模式，结果见图2、图3。确定了15批忍冬藤标准煎液中10个共有峰，并指认峰4为绿原酸，峰5为咖啡酸，峰10为马钱苷（S峰），见图4。 2.3.6 指纹图谱相关性分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》计算相似度，结果见表5。15批忍冬藤饮片特征图谱的相似度均在0.95以上；15批忍冬藤标准煎液特征图谱的相似度均在0.96以上，表明15批忍冬藤标准煎液有良好的相似性。比较忍冬藤饮片、标准煎液的特征图谱，对共有峰进行分析可知，忍冬藤标准煎液10个特征峰在饮片中均能得到追踪，表明忍冬藤标准煎液与饮片化学成分基本一致，见图5。 3 讨论 忍冬藤以茎枝入药，为清热解毒类中药，不宜久煎，通过对煎煮时间和加水量的考察，并参考《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号），确认一煎加10倍水，煎煮20 min，二煎加8倍水，煎煮15 min；为了防止有效成分热分解，尽可能保留原成分，本试验采用《中药饮片标准煎液研究策略》[6]分离和浓缩方法，对药渣和药液进行趁热过滤、迅速冷却及低温减压浓缩（温度不超过60 ℃）处理；为尽可能去除药液中的杂质，保证药液的正常过滤，通过对分离药渣和药液的筛网进行考察，优选出用200目筛网进行固液分离，最大限度达到与临床汤剂一致的目的。 标准煎液以水为溶媒，在煎煮过程中药效成分已被提取出来，因此采用超声方式溶解即可。本试验对提取溶媒和提取时间进行了考察，分别以50%甲醇、75%甲醇和100%甲醇作为提取溶媒，结果表明以50%甲醇提取较完全，故选用50%甲醇作为提取溶剂；选择10、20、30 min进行提取时间考察，结果提取效率没有差异，故选择超声10 min进行提取即可。 绿原酸、咖啡酸和马钱苷是忍冬藤的主要活性成分，易溶于水、甲醇，标准煎液以水为提取溶媒，测定这3个成分的含量能够更好地整体评价忍冬藤的内在质量。以其作为制剂的含量测定指标，采用中药饮片标准煎液来标化忍冬藤不同用藥形式，可以提高临床用药的准确性和疗效的一致性，对保证药品质量具有实际意义。 本试验基于HPLC和UPLC建立了忍冬藤饮片标准煎液的含量测定方法及特征图谱方法，克服了单一成分信息量不全的缺点；忍冬藤标准煎液与饮片特征图谱的主要色谱峰基本一致，其对照特征图谱的相似度高达0.994以上，表明忍冬藤标准煎液与饮片主要化学成分基本等同，保证其质量的一致性，含量测定结合特征图谱能够较全面可靠地控制忍冬藤标准煎液的内在质量；方法学考察中，精密度、重复性、稳定性的RSD均小于3%，表明此方法准确、可行、重复性良好。本研究可为忍冬藤配方颗粒的质量控制和评价提供可靠的数据参考。 参考文献： [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：193. [2] 陈玲，张海艳，李晓，等.忍冬的化学成分研究进展[J].现代药物与临床，2015，30（1）：108-113. [3] 贾献慧，王晓，张永清.忍冬藤酚酸类化学成分分离[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（5）：69-71. [4] 宋亚玲，王红梅，倪付勇，等.金银花中酚酸类成分及其抗炎活性研究[J].中草药，2015，46（4）：490-495. [5] 赵媛媛，杨倩茹，郝江波，等.金银花与忍冬藤及叶药理作用差异的研究进展[J].中国中药杂志，2016，41（13）：2422-2426. [6] 陈士林，刘安，李琦，等.中药饮片标准煎液研究策略[J].中国中药杂志，2016，41（8）：1367-1375. （收稿日期：2018-06-21） （修回日期：2018-07-13；编辑：陈静） |
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