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标题

响应面法优选达原饮颗粒的提取工艺

范文

欧阳炜　朱雅玲　洪笃云

摘要目的：优选达原饮颗粒的最佳提取工艺。方法：采用Box-Behnken响应面法，以浸膏得率与厚朴酚、和厚朴酚含量的总评归一值为评价指标，对达原饮颗粒提取工艺条件进行优选。结果：得到达原饮颗粒的最优值为提取次数2.42次，提取时间0.96 h，加溶剂量10倍，预测值OD=0.948，根据实际生产选择最优条件为提取时间55 min，加水量10倍，提取2次，OD=0.895。结论：优选得到的提取工艺经验证重复性高，结果稳定。

关键词达原饮颗粒;提取工艺;Box-Behnken响应面法;含量测定;厚朴酚;和厚朴酚;瘟疫;经典方

Abstract Objective：To optimize extraction process of Dayuan Granules.Methods：Based on Box-Behnken design-response surface method，the sum of the extraction yield，magnolol，and magnolol content were the evaluation index and the extraction process conditions of Dayuanyin Granules was optimized.Results：The optimal value of Dayuanyin Granules was 2.42 extraction times，0.96 h extraction time，10 times the amount of solvent added，and the predicted value OD=0.948.According to the actual production，the optimal conditions were selected as 55 minutes extraction time and 10 times the amount of water added.Extracted twice，OD=0.895.Conclusion：The optimized extraction process has been verified to have high repeatability and stable results.

Keywords Dayuan Granules; Extraction technology; Box-behnken response surface method;Content determination; Magnolol; Honokiol; Pestilence; Classic prescriptions

中圖分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.011

达原饮是明代吴又可《温疫论》中的经典方，处方组成：槟榔、厚朴、草果、知母、芍药、黄芩、甘草。具有开达膜原，辟秽化浊的功效。古代用于治疗瘟疫、时疫，为疏利疫邪之要方。现代主要用于辨证为湿热秽浊，郁伏膜原引发的发热症状[1-2]。在各种流感病毒流行越来越猛烈的今天，西药在治疗上越显乏力，在“SARS”“H7N9”“新型冠状病毒”时期，中医药都发挥出了优势，开发有临床疗效的经方验方意义深远[3-5]。本研究将采用Box-Behnken响应面法（BBD-RSM）对达原饮的制备工艺进行优选，并开发为院内制剂。BBD-RSM法是一种评估考察因素非线性影响的响应曲面方法，并根据函数表达式计算最优值，然后找到各考察因素间的最佳组合。因此，BBD-RSM能找到整个区域上的最佳水平。因拥有比正交实验高的精密度，比其他响应面法较少的实验次数，不需要多次连续实验，且可以对实验结果进行预测，常用于提取工艺寻找最优工艺[6]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1200型高效液相色谱仪、RE-52AA旋转蒸发器（上海）、ZK-82A真空干燥箱（上海）、Bp211D电子分析天平（德国）。

1.2 试剂对照品均购于中国食品药品检定研究院（厚朴酚：批号110729-201714、和厚朴酚：批号110730-201614）。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3 分析样品药材槟榔、厚朴、草果、知母、芍药、黄芩、甘草由广东省第二中医院中药房提供，经检验均符合《中华人民共和国药典》2015版一部各饮片项下要求。

2 方法与结果

2.1 厚朴酚与和厚朴酚的含量测定[7]

2.1.1 色谱条件色谱柱 Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：甲醇-水（70∶30）;波长：294 nm;柱温：30 ℃;流速：1 mL/min。

2.1.2 对照品溶液制备分别精密称取两对照品，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，制成含厚朴酚924.1 mg/L的对照品溶液和含和厚朴酚463.6 mg/L对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备精密称取达原饮提取液2 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，精密称重后超声（500 W，40 kHz）30 min，放至常温，精密称重并加甲醇补重至超声前重量，摇匀，滤过，取滤液。

2.1.4 阴性样品溶液制备按达原饮提取液的提取方法，去除厚朴，制成阴性提取液，按照“2.1.3”项下方法制成阴性样品溶液。

2.1.5 标准曲线的绘制分别精密吸取浓度为2、4、8、10、12、14 μL的厚朴酚对照品溶液、2、8、12、16、20、24 μL的和厚朴酚对照品溶液，横坐标为对照品浓度（μg/mL），纵坐标为峰面积值，求得回归方程：厚朴酚Y=39 727X+6 102.4，r=0.999 6;和厚朴酚Y=41 225X+1 622.1，r=0.999 7。厚朴酚在1.848～12.94 μg范围内，和厚朴酚在0.927 2～11.13 μg范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.6 精密度试验精密吸取厚朴酚（924.1 mg/L）对照品溶液，和厚朴酚（463.6 mg/L）对照品溶液各10 μL，按照2.1.1项连续进样6次，测得厚朴酚峰面积及和厚朴酚峰面积，RSD分别为0.64%、0.71%（n=6），符合RSD<2%的要求，该仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液7份，按2.1.1项在制备后的0、2、4、6、8、10、12 h进样分析，测得厚朴酚的RSD1.31%（n=6），和厚朴酚峰面积的RSD1.52%（n=6），供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.8 重复性试验按上面方法制得达原饮供试品溶液6份，进样测定并计算厚朴酚与和厚朴酚的含量。厚朴酚含量的RSD为0.81%（n=6）、和厚朴酚含量的RSD为1.62%（n=6），表明该方法重现性良好。

2.1.9 加样回收试验取已知含量的达原饮提取液，分别加入适量厚朴酚与和厚朴酚对照品溶液（厚朴酚924.1 mg/L、和厚朴酚463.6 mg/L），制备供试品溶液并进行测定，计算加样回收率，结果表明厚朴酚与和厚朴酚的平均回收率分别为101.2%，99.3%，RSD分别为1.35%、1.29%。

厚朴酚、和厚朴酚与其他组分的色谱图见图1。其中供试品的和厚朴酚出峰时间为4.32 min，峰面积为289 255.2，厚朴酚出峰时间为5.11 min，峰面积为321 883.01。

2.2 浸膏得率的测定

精密吸取达原饮浓缩液20 mL置己恒重的蒸发皿，水浴蒸干，按《中华人民共和国药典》2015年版四部干燥失重测定法计算干膏得率。计算公式：干膏得率（%）=（W×V）/（20×Wt）×100%（W为20 mL浓缩液中干浸膏重量，V为定容体积，Wt为药材重量）。

2.3 Box-Behnken效应面法试验[8-10]

2.3.1 Box-Behnken优化设计采用Design-Expert8.0.6软件中的Box-Behnken试验设计方案，选取提取时间（A）、加水量（B）、提取次数（C）作为影响因素，采用总评归一值法（overalldesirability，OD）处理多指标数据。浸膏得率及含量指标越大越好，采用Hassan方法，求归一值[11]。公式：di=（yi-ymin）/（ymax-ymin），OD=（d1d2d3……dk）1/k，i=1，2，3，…，n，k为指标数。见表1。

2.3.2 模型拟合及分析

运用Design-Expert8.0.6软件，以总评OD值为响应值，采用多元二次回归方程得到因素与响应值的方程为：OD=-2.275+1.657A+0.037 2B+1.761C-0.020 3AB-0.273AC-4.539×10-3BC-0.414A2+7.846×10-4B2-0.300 3C2，从表2中可以看出A、B、C、AC、A2、C2均具有统计学意义，影响提取效果为C>A>B，F=64.59，模型项P<0.000 1，模型高度显著，实验误差小。失拟项F=1.76，P=0.293 9>0.05，表明失拟项无统计学意义，相关系数R2=0.998 8，说明模型拟合度好，回归方程能准确预测实际情况。综上所述，模型可以有效的优化出达原饮颗粒的最佳提取工艺，且实用性强。

2.4 效应面分析及实验预测

采用Design-Expert8.0.6软件，根据回归分析结果，固定其中的某1个因素，绘制另外2个因素对总评OD值影响的三维曲面和等高线图（图2）。当等高线图呈椭圆形，越接近最佳值，面的弯曲度就越大。图中红点为最高点，等高线呈椭圆形，3D图陡峭，表示交互作用显著。在C因素方向的响应面曲线明显比A、B因素方向较陡，说明C因素对响应值OD的影响高于A、B因素。从图2中可以看出，AC具有显著性交互作用，这和方差分析的结果相一致。经软件计算得到达原饮颗粒的提取工艺参数最优值为提取次数2.42次，提取时间0.96 h，加水量10倍，预测值OD=0.948。因提取次数需要取整数，经单因素试验，提取3次相比于提取2次效果并不很显著，将提取次数定为2次。最终选择为提取2次，55 min/次，加水量10倍。根据回归分析结果，得效应面图。见图2。

2.5 验证试验

通过软件对上述优选工艺进行处理分析，得到试验预测值为OD=0.895。按优选工艺再进行3次验证试验，与预测值的偏差为0.002 7%，偏差较小，表明所选工艺稳定性好，可信度高。见表3。

3 讨论

达原饮中槟榔辛散湿邪，化痰破结，使邪速溃，为君药。槟榔主要成分为槟榔碱，但槟榔碱在高温下易分解，易溶于水随着水蒸气而挥发，达原饮颗粒经水煎煮提取，槟榔碱减少50%以上，且槟榔碱为小分子生物碱，在C18柱上不易保留，不适合作为含量测定指标[12-13]。厚朴芳香化浊，理气祛湿为臣药。厚朴酚与和厚朴酚在厚朴中含量较高，性质稳定，國内外研究较多，常作为含量测定指标，故选取之[14-15]。

可以将复杂的未知函数，在小区域内进行一次或二次多项式模型拟合，对实验考察的各个水平进行连续分析，在一个区域内直观地反映各因素与响应值之间的关系，找到最优值。而常用的正交试验是线性模型设计，考察的只是已设定好的水平组合，得到的不一定是最优组合。响应面法常用的有星点设计响应面法和Box-Behnken响应面法，Box-Behnken响应面法适用于3～7因素的实验设计，实验次数较星点设计法少，实验结果不会超出设定水平，实验结果更能为生产提供依据[16]。虽然在试验次数上，响应面法比正交试验法有所增加，但在中药提取中，涉及的考察因素之间的相互影响，一般都是非线性的，Box-Behnken响应面法得到更理想的实验结果，且能提供各因素的交互作用影响，为实际生产提供更多的有效信息。

经典名方因历史悠久，对某些疾病的療效确切，国家政策的扶持等原因，被大量开发研究。但目前的含量考察仅以提取率和主成分含量作为标准，不能很好体现中药复方制剂的特点。近两年提出中药饮片标准汤剂和物质基准的概念，标准汤剂是基于中药饮片水煎液的质量标准，更符合作为制剂开发的含量考察标准。物质基准目的是保证中药材、中药饮片、标准颗粒间的一致性。建立更完善的考察标准，将有利于经典方开发成有临床价值的制剂[17-18]。

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（2019-04-11收稿责任编辑：杨觉雄）

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