| 标题 | 一株高效苯酚降解菌的筛选及降解性能考查 |
| 范文 | 石瑞文 哈妮 郭楠 张晓琴 关海滨 摘 要 从炼油厂废水排放口附近污染较为严重的土壤样本中驯化筛选、鉴定苯酚降解菌株，对该菌株在不同苯酚浓度下进行降酚能力的考查。方法 采用以苯酚为唯一碳源、逐量分批的方法驯化、筛选苯酚降解菌株，利用形态学、生理生化反应以及16SrDNA序列鉴定菌株。结果 筛选到一株苯酚降解菌株，鉴定为不动杆菌属，该菌株48h内对苯酚（1.5g·L-1）的降解率为82.86%。结论 经过驯化筛选和苯酚降解条件的优化，所得苯酚降解菌株具有良好的苯酚降解能力。 关键词 苯酚降解菌 驯化筛选 降解性能 中图分类号：X703 文献标识码：A 工业化程度的提高使许多工厂大量排放含酚废水，水中生物的生存和饮用水水源质量等都遭到极大的威胁。 生物法处理含酚废水具有能耗少、处理效率高、二次污染少等优点。本研究旨在从酚类污染物排放企业所排出的污泥以及被污染的土壤中筛选获得高效降酚菌群并分离出单一高效降酚菌株，通过对获得的高效降酚菌株降酚能力的考查、培养基的优化以及鉴定分类，为相关研究提供实验参考，为工业化处理含酚废水提供理论依据。 1材料与方法 1.1培养基 （1）唯一碳源培养基：苯酚终浓度分别为0.1g·L-1至1.5g·L-1。 （2）富集培养基：蛋白胨10. 0g·L-1，牛肉浸膏5. 0 g·L-1，NaCl 5. 0 g·L-1，pH7. 0。 （3）富集（分离）固体培养基：苯酚浓度若干、琼脂浓度为15.0 g·L-1。 1.2实验方法 1.2.1苯酚降解菌的分离与纯化 选取炼油厂废水排放口附近污染较为严重的土壤，溶于无菌蒸馏水中，将其稀释液涂布于含有苯酚的分离固体培养基梯度平板上。32℃培养36～48h。选取生长在苯酚浓度较高区域并且形态较好的细菌单菌落，于分离固体斜面培养基上扩大培养。 1.2.2苯酚降解菌株的驯化、筛选 将1.2.1所得菌株接入含0.1 g·L-1苯酚的唯一碳源培养基中，32 ℃，pH7.0，150 r/ min 振荡培养24 h。重复上述培养过程，直至苯酚浓度达到1.5 g·L-1，选取单位时间内降酚率较大的菌株。 1.2.3苯酚降解菌生长量的测定及苯酚濃度的测定 以OD 600nm代表该菌体的生长状况，采用4-氨基安替吡林法测定苯酚浓度。 1.2.4苯酚降解率的计算 降解率（%） = （1-反应后苯酚浓度/ 苯酚起始浓度） ？100 % 1.2.5苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查 选取不同培养温度（T）、三角瓶装量（V）、摇床转速（v）等因素对培养条件进行单一条件及正交优化。 1.2.6不同苯酚浓度下苯酚降解菌株的降酚能力考查 将处在对数生长期的菌液按5%的接种量接入含苯酚浓度分别为0.3g·L-1、0.5g·L-1、1.0g·L-1、1.5g·L-1的唯一碳源培养基中，32℃，pH7.0，150r·min-1培养，计算48h内苯酚降解率。 1.2.7苯酚降解菌的鉴定 （1）传统方法鉴定。通过降酚菌株的个体和菌落特征、生长状况、革兰氏染色以及生理生化反应初步鉴定该菌株。 （2）分子鉴定。设计细菌的16SrDNA序列通用引物，扩增其16SrDNA序列，引物序列F1：5′CCCAAGCTTGGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，F2：5′CGGAATTCCGTACGGTTACCTTGTTACGACTT3′，扩增条件94℃、3min；（94℃、30sec；52℃、30sec；72℃、1 min）30个循环；72℃、5min；4℃保存，测序。 2结果 2.1苯酚降解菌株的分离筛选 经过分离筛选，共挑取30株耐酚菌株，选取其中降酚率较高且遗传稳定的一株菌（HSG-18072313）作后续研究。 2.2苯酚降解菌株降解苯酚性能的考查 菌株HSG-18072313最佳降解苯酚的培养温度（T）、三角瓶装量（V）、摇床转速（v）分别为：30℃、50ml/250ml、150r·min-1。 2.3不同苯酚浓度下菌株HSG-18072313的降酚能力 48h内对苯酚浓度为0.3g·L-1、0.5g·L-1、1.0g·L-1、1.5g·L-1降解率分别为93.28%、92.34%、89.56%、82.86%。 2.4菌株的鉴定 菌株HSG-18072313显微形态为杆状，菌落圆形，表面及边缘光滑整齐，颜色为浅黄色，革兰氏染色呈阴性。 利用blast软件将菌株HSG-18072313的16SrDNA序列与Genebank中已报道的16SrDNA序列进行同源性比较，结果表明菌株HSG-18072313的16SrDNA序列与在Genebank登记的多株不动杆菌属的菌株具有高度的同源性（≥97%）。 结合显微和菌落鉴定结果、生理生化反应、分子鉴定，将HSG-18072313归属为不动杆菌属。 （通讯作者：关海滨） 基金项目：内蒙古医科大学2018年度大学生创新创业训练计划校级项目（2018101320041）；内蒙古医科大学2017年度本科教学工程和教育教学改革项目（NYJXGG2017022）。 作者简介：石瑞文（1981-），男，硕士研究生，讲师；通讯作者：关海滨（1982-），男，硕士研究生，副教授，研究方向：生物技术药物。 |
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