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标题

沃替西汀氢溴酸盐抑制肠道菌群

范文

束慧

摘要-葡萄糖醛酸苷酶（GUSB）是一类重要的存在于肠道菌群代谢物中的酸性水解酶，可催化分解具有 -葡萄糖醛酸苷结构的底物。肠道菌群产生的GUSB可影响多种药物的药代动力学行为，例如，伊立替康等药物的葡萄糖醛酸化产物可被肠道菌群产生的GUSB分解成为苷元并在肠道局部累积，可能引发严重的胃肠不良反应。因此，寻找或开发高效抑制肠道菌群产生的GUSB活性的药物，对于缓解一些临床药物产生的副作用而引发的严重腹泻具有重要意义。在本课题中，我们发现沃替西汀氢溴酸盐可以高效地抑制GUSB活性。

关键词沃替西汀氢溴酸盐-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂肠道菌群

中图分类号：R914文献标识码：A

近年来，肠道菌群与多种疾病研究已成研究的热点。近些年来一些研究成果表明，肠道菌群与多种神经系统疾病的发生、药物的吸收及代谢过程密切相关。 -葡萄糖醛酸苷酶（ -glucuronidase，GUSB），编号EC3.1.1.31，是溶酶体内的酸性水解酶，可催化 -D-1，4-葡萄糖醛酸苷糖苷键发生水解，释放出 -葡萄糖醛酸和相应的配基。

人源GUSB的蛋白质结构与大肠埃希菌（E. coli）的GUSB蛋白质晶体结构先后被解析出来。1996年Jain等人首次解析了人源GUSB的蛋白质晶体结构，2010年Wallace等人对大肠埃希菌的GUSB蛋白质晶体结构完成的解析。大肠埃希菌GUSB蛋白质结构由2种不同的亚基组成，每个亚基含597个氨基酸残基，相对分子质量均约为70 KD;N端由180个氨基酸残基组成，C端的折叠由274-603氨基酸残基够成;催化活性结合位点为Glu 413和504，相邻亚基之间的菌环结构（bacterial loops）。大肠埃希菌产生的GUSB与人源GUSB的氨基酸序列相似度约为45%，大肠埃希菌GUSB蛋白结构中具有菌环结构，但是人源GUSB无此结构。因此，可以根据大肠埃希菌GUSB中的菌环结构设计出特异性抑制剂。目前常见的GUSB活性检测方法主要有以下3种：比色分析法、荧光法和高效液相色谱法。本研究使用比色分析法对大肠埃希菌 GUSB进行活性检测。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

沃替西汀氢溴酸盐（美国Selleck公司， S8021）; -葡萄糖醛酸酶（美国Sigma公司，G7646-5KU ） ;4-硝基苯基 -D-葡糖苷酸（美国Sigma公司，73677-250MG ）;4-硝基苯酚（美国Sigma公司，1048-5G）;大肠埃希菌（实验保存）;细菌用蛋白酶抑制剂复合物（生工，C500027-0001）;磷酸盐缓冲液（pH7.4）;粪便蛋白提取液;超声破碎仪（赛飞公司，Biosafer 650-92）;水浴鍋（其林贝尔）;酶标仪（美国Thermo公司，Mlutiskan FC）。

1.2-葡萄糖醛酸苷酶活性分析

1.2.1-葡萄糖醛酸苷酶纯酶活性检测

将 -葡萄糖醛酸苷酶纯酶粉末配制成5U/ul溶液，取33ul加入到1.617 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中混合均匀，加入到96孔板的33孔中。使用PBS将沃替西汀氢溴酸盐配制成以下浓度：30，10，3.33，1.11，0.37，0.123，0.041，0.0137，0.0046，0.0015 uM，各取100ul加入到含有 -葡萄糖醛酸苷酶的96孔板中，每个浓度做3个复孔。每孔加入2ul（25mM）反应底物4-硝基苯基 -D-葡糖苷酸（PNPG），37℃避光反应1小时。使用1xPBS将4-硝基苯酚（PNP）稀释成浓度分别为1，5，10，20，40，80，100和200uM的标准溶液，各取100ul上述标准液，各加入150ul 0.2M Na2CO3，混匀1min，405nm测定其吸光度，得到标准曲线方程式，依次计算出对硝基酚法所测得的每毫升反应液中所含对硝基酚的含有量。

1.2.2大肠埃希菌中 -葡萄糖醛酸苷酶纯酶活性检测

将1ul大肠埃希菌菌液使用9ul灭菌的PBS稀释后，涂布于无抗性LB固体培养基，倒置在37℃过夜培养。挑取2个克隆分别加入含有5ml LB液体培养基的50ml离心管中，置于37℃摇床，200rpm孵育过夜。4000rpm离心5min，弃LB液体培养基，加入10ml预冷的PBS洗涤两次，离心弃PBS，再次加入2ml预冷的PBS（含20ul 细菌用蛋白酶抑制剂复合物），超声破碎至液体变澄清，12000rpm离心30min，取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒，检测蛋白浓度。取3ul（1.61ug/ul）裂解产物检测其中 -葡萄糖醛酸苷酶的活性，加入不同浓度的沃替西汀氢溴酸盐。沃替西汀氢溴酸盐浓度及相关步骤参照1.3.1。

1.3统计学分析

实验数据录入Prism 5.0 （GraphPad Software）统计软件进行分析，数据用均数？标准差（ x ？s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2.1?-葡萄糖醛酸苷酶纯酶活性检测

以对硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）作为标准品，绘制标准曲线，得出 y = 0.0042x + 0.0612，R2 = 0.9964（图1-A）。根据所得到的OD值，计算出IC50=0.2212 uM（图1-B）。高浓度沃替西汀氢溴酸盐组的 -葡萄糖醛酸苷酶纯酶活性，相比于PBS组下降明显;低浓度沃替西汀氢溴酸盐组的 -葡萄糖醛酸苷酶纯酶活性，相比于PBS组没有显著性差异（图1-C）。

图1（A）PNP作为标准品得到的标准曲线，y = 0.0042x + 0.0612，R2 = 0.9964;（B）100ul不同浓度沃替西汀氢溴酸盐与5U GUSB及2ul（25mM）PNPG反应，计算得到IC50=0.2212 uM;（C）100ul不同浓度沃替西汀氢溴酸盐与2ul（25mM）PNPG反应所得OD值的统计学结果显示，0.0137，0.0046和0.0015 uM组分别与对照组相比没有统计学意义，30，10，3.33，1.11，0.37，0.123和0.041uM组分别与对照组相比有统计学意义，p<0.001。

2.2沃替西汀氢溴酸盐对E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性的影响

以对硝基苯酚（P-nitrophenol，PNP）作为标准品，绘制标准曲线，得出 y = 0.0043x + 0.0698，R2 = 0.9937（图2-A）。根据所得到的OD值，计算出IC50=0.9043 uM（图2-B）。高浓度沃替西汀氢溴酸盐组的E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性，相比于PBS组下降明显，有显著性差异（ P<0. 01）;低浓度沃替西汀氢溴酸盐组的E. coli中 -葡萄糖醛酸苷酶活性，相比于PBS组没有显著性差异（图2-C）。

圖2（A）PNP作为标准品得到的标准曲线，y = 0.0043x + 0.0698，R2 = 0.9937;（B）100ul不同浓度沃替西汀氢溴酸盐与3ul（1.61ug/ul）E. coli裂解产物及2ul（25mM）PNPG反应，计算得到IC50=0.9043 uM;（C）100ul不同浓度沃替西汀氢溴酸盐与3ul（1.61ug/ul）E. coli裂解产物及2ul（25mM）PNPG反应所得OD值的统计学结果显示，1.11，0.37，0.123，0.041，0.0137，0.0046和0.0015 uM组分别与对照组相比没有统计学意义，30，10，3.33和1.11uM组分别与对照组相比有统计学意义，p<0.001。

3讨论

肠道菌群和多种疾病的产生有着密切的相关性，已成为多种疾病治疗靶点。肠道菌群产生的GUSB可催化诸多药物发生水解，释放的苷元会引起严重的迟发型腹泻，沃替西汀氢溴酸盐通过抑制GUSB活性，减少相关药物的葡萄糖醛酸苷产物发生水解，确保肠道菌群的种类及数量的平行，达到治疗迟发型腹泻的效果。近年来，随着对药物研究的不断深入，新药的开发成本太高、周期太长，新药老用已成为研究的热点。我们还可以从一线临床用药、中草、食品或土壤成分寻找肠道菌群中GUSB的特异性抑制剂，结合高效安全的生物学和化学衍生技术获得更加安全高效的肠道菌群中GUSB活性抑制剂。

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