| 标题 | 地鳖虫活性蛋白分离纯化及药理学进展 |
| 范文 | 贾强 沈宏萍 仁德芳 曾海燕 袁纪元 摘要：地鳖虫作为一种传统的重要中药材，在我国人工养殖发展迅速，从而地鳖虫的来源丰富，价格便宜，从而广泛的应用于中药处方中。随着时代的进步，其主要的活性成分纤溶蛋白质、脂多糖等，现已实现了分离纯化。针对地鳖虫的现代药理学机制等研究越来越多，并且成为热点。目前已有大量研究证实地鳖虫活性蛋白具有抗肿瘤、抗氧化、抑制血管生成及抗凝血等作用，本文就地鳖虫活性蛋白的分离纯化及药理活性研究进行简单的概述，为地鳖虫的应用前景进行提供参考。 关键字：地鳖虫;活性蛋白;抗肿瘤、抗氧化、抑制血管生成 【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）01-000-02 地鳖虫Eupolyphage sinensisWalker，又名土元、土鳖，属节肢动物门昆虫纲蜚蠊日鳖蠊科动物，早在《神农本草经》及《金匮要略》等均对其有明确记载，该药味咸，寒，具有逐瘀、破积、通络、理伤等药用功效，主治癥瘕（即肿块、肿瘤）积聚、经闭、瘀血、腹痛、跌打损伤等症[1-3]。其中的活性蛋白成分由于其具有溶解静脉血栓，抗氧化衰老、抗肿瘤等药用功效成为了学者们研究的热点。 1. 地鳖活性蛋白的分离纯化 韩雅莉等人[4]将新鲜地鳖经匀浆、盐析和透析得到蛋白质粗提物通过DEAE-52离子交换纤维素层析分离后洗脱出现了3中蛋白峰，选择第3组蛋白含量较高的峰，并通过DS-PAGE电泳检测，其电泳图谱显示出单一蛋白带，最终纯化最终提取到了蛋白质的单一组分——纤溶活性蛋白（EFP）。EFP经测定其相对分子质量为41300，总含糖量为7.03%，经IR分析后确定EFP为一种糖蛋白。 王凤霞等人[5]，通过硫酸铵沉淀、超滤、CM-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF 及 Q-Sepharose HP 离子交换、Butyl Sepharose HP 疏水色谱以及 Superdex 75 凝胶过滤色谱法分离纯化得到单链蛋白活性组分EPS72，其分子质量约为72 kD，对人肝癌Bel-7402 细胞、肺癌 A549 细胞、宮颈癌 Hela 细胞、结肠癌 RKO 细胞以及胰腺癌 Panc-28 细胞均有明显的增殖抑制作用，提示该蛋白成分具有潜在的广谱的抗癌活性。 王淑敏等人[6]，采用水提醇沉法提取地鳖虫蛋白质粗液，将其通过CM-Sepharose FastFlow离子交换柱层析的方法得到3个组分，其中组分Ⅲ的纤溶活性最高，经透析、冻干后，呈淡黄色粉末，且易溶于水。 将组分III 经Sephadex G-50凝胶过滤柱层析，再得到3个组分Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。组分Ⅵ活性最高，经透析、冻干后，呈白色絮状，易溶于水。经反相高效液相色谱柱层析，收集保留时间为17 min左右。 2. 地鳖活性蛋白的抗肿瘤作用 曹付春等人[7]，研究了EFP对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人肺癌（A 549）、乳腺癌（MCF- 7）细胞分泌血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），发现EFP含药血清对人脐静脉内皮细胞、肺癌、乳腺癌细胞的VEGF和bFGF表达均有抑制作用，提示EFP可抑制肿瘤细胞VEGF和bFGF表达。而恶性肿瘤生长可分为无血管的缓慢生长阶段与有血管的快速增殖阶段，若无血管生成，则原发肿瘤的生长缓慢，从而提示EFP通过抑制血管内皮细胞增殖，减少有关促血管生长因子VEGF、bFGF等蛋白的表达，抑制肿瘤血管生成。 林泽飞等人[8]，将不同浓度 EFP 小鼠含药血清，对 A549 细胞做了增殖抑制效果考察，采用 MTT 法、流式细胞术、Annexin V - FITC/PI 双荧光染色法以及免疫组织化学法验证 EFP 对A549 细胞做了增殖作用，发现随着 EFP 剂量的增大，A549 细胞凋亡数增加，其中高浓度和中浓度的凋亡率接近;EFP 能够延缓 G0 /G1 期向 S 期过渡，改变细胞的周期分布，使细胞阻滞于 G0 /G1 期，抑制 A549 细胞的增殖活性;EFP 含药血清组的Bcl-2阳性率降低，Bax 阳性率升高，提示EFP 可增强肺癌 A549 细胞 bax 的表达，抑制 Bcl - 2 的表达，从而抑制其生长，其机制可能是通过下调 Bcl-2 蛋白表达和上调 Bax 蛋白表达，促进肿瘤细胞凋亡。 刘浩等人[9]建立了S180腹水瘤、实体瘤模型以及H22荷瘤腹水瘤、实体瘤模型。将S180腹水瘤小鼠、S180实体瘤小鼠、H22腹水瘤小鼠以及H22实体瘤小鼠分别40只，每个类别随机分5组（8只/组），阳性对照组（注射环磷酰胺），阴性对照（注射生理盐水），药物高剂量组，中剂量组，低剂量组，将40只以及40只，分别随机分5组（8只/组），阳性对照组。结果发现，在EFP浓度2.90mg·kg- 1对S180腹水瘤、2.18mg·kg- 1对H22肝癌和0.73～ 1.45mg·kg- 1对S180实体瘤的荷瘤小鼠的肿瘤生长有明显抑制作用。在高浓度的EFP对小鼠的S180实体瘤抑瘤率与环磷酰胺相似，在低浓度EFP对H22实体瘤抑瘤率最高，且高浓度下小鼠脾重最大。提示，地鳖蛋白对S180和H22肿瘤细胞均具一定的抑制作用，且抑制效果和环磷酰胺类似。且EFP对S180等细胞无杀伤效果，说明EFP对S180、H22荷瘤小鼠存在显著抑瘤作用，而无明显的细胞毒作用。 3. 地鳖活性蛋白抗氧化衰老作用 谷崇高等人[10]，通过小鼠连续腹腔注射D-半乳糖 20 d，建立了小鼠衰老模型，对模型小鼠每日灌服 0、40、80、160 mg / kg地鳖多肽提取物，衰老组以及对照组小鼠每天灌服等量生理盐水，观察小鼠的正常活动、运动和耐应激能力。分别采用黄嘌呤氧化酶法、分光光度法检测小鼠血液和不同组织中超氧化物歧化酶（ SOD） 、过氧化氢酶（ CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（ GSH-PX） 活力，以及丙二醛（ MDA） 和还原型谷胱甘肽（ GSH）含量，免疫荧光法检测细胞核转录因子 2（ Nrf2） 在 Caco-2 细胞的表达。结果显示，与对照和多肽组比较，衰老组小鼠体重增重缓慢、组织脏器系数降低、运动时间缩短、抗应激能力降低、组织中抗氧化酶活力降低。多肽组小鼠体重增加明显，肝脏、脾脏和肾脏指数增加显著，小鼠静力和动力运动时间明显延长，并与地鳖多肽剂量的呈正比关系。与对照组比较，剂量组小鼠耐缺氧、耐高温和运动时间延长并与之接近，血液和不同组织中的 SOD、CAT、GSH-PX 活力及 GSH 含量显著提高，但MDA 含量降低，Caco-2 细胞核内 Nrf2 表达量明显增加，接近阳性对照组。由此可知，地鳖多肽可能通过启动 Nrf2-ARE 抗氧化信号通路，提高 D-半乳糖致衰老小鼠抗应激和抗氧化能力，从而延缓小鼠氧化衰老。 4. 结语： 综上所述，地鳖活性蛋白具有良好的药理活性，特别是在抗肿瘤方面，有较好的开发潜力。 参考文献： [1] 姜珊，董萍萍，李浩然，徐静，李华健，于盈盈，代龙，高鹏，王少平，张加余.土鳖虫活性肽DP17对高脂血症大鼠的降脂作用机制研究[J].中国中药杂志，2020，45（21）：5265-5272. [2]张慧明，富尧，白淑菊，刘爽，吕冬云.地鳖虫醇提物对肿瘤细胞侵袭与凋亡的作用机制[J].中国老年学杂志，2020，40（21）：4616-4620. [3]Xin Xie，Wen Shen，Yiran Zhou，Lingman Ma，Duiyue Xu，Jialu Ding，Liangyuan He，Baiyong Shen，Changlin Zhou. Characterization of a polysaccharide from Eupolyphaga sinensis walker and its effective antitumor activity via lymphocyte activation[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2020，162. [4] 罗情， 巫秀美， 郭娜娜，罗建蓉，肖怀. 地鳖虫的化学成分和药理活性研究进展[J]. 中国医药科学， 2015（17）：41-44. [5]王凤霞，刘明，王惠，刘格，吉爱国.中华真地鳖抗肿瘤蛋白纯化、鉴定及活性研究[J].中国生化药物杂志，2012，33（05）：519-523. [6] 王淑敏，赵学良，王本祥，周秋丽，刘忠英，安汝国，刘志强，刘淑莹.中药土鳖虫溶栓成分的分离纯化研究[J].分析化学，2005（10）：1385-1388. [7] 曹付春，韩雅莉，陈冰，黄明星，丁鸿，余磊，叶韵.地鳖纤溶蛋白对人脐静脉内皮细胞、肺癌、乳腺癌细胞VEGF和bFGF表达的影响[J].时珍国医国药，2011，22（08）：1827-1829. [8] 林泽飞，韩雅莉，陈冰.地鳖纤溶活性蛋白含药血清对人肺癌A549细胞凋亡及凋亡相关表达的影响[J].时珍国医国药，2013，24（04）：807-810. [9] 刘浩，韩雅莉，丁鸿，黎子蔚.地鳖纤溶蛋白对荷S_（180）和H_（22）小鼠的抑瘤作用研究[J].时珍国医国药，2010，21（09）：2140-2142. [10] 谷崇高，张永红，白若雨，田美杰，沈红.地鳖多肽提取物的抗氧化衰老机制[J].中国实验动物学报，2014，22（06）：66-74. 通讯作者： 袁纪元（1992-），女，西南医科大学硕士，研究方向为：新型药物递送系统设计与系统评价。 作者简介： 贾强（1992-），男，西南医科大学学士，研究方向为：新型药物递送系统设计与系统评价; 沈宏萍高级职称 研究方向：药物临床试验机构管理与临床药理 仁德芳（1991-），女，西南医科大学硕士，研究方向为：新药临床。 曾海燕（1986-），女，硕士，研究方向为：流行病学。 基金项目：2018年度西南醫科大学校级基金资助项目 西南医大校【2018】138号 西南医科大学附属中医医院 四川泸州 646000 |
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