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标题

JWH133对MPP+诱导的原代星形胶质细胞COX-2和iNOS表达的影响

范文

贾翼邓晗马泽刚

[摘要] 目的探讨大麻素Ⅱ型受体（CB2受体）激活对1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP+）诱导原代星形胶质细胞炎症反应的影响。方法培养原代星形胶质细胞，生长状态良好时将其分为Control组、MPP+组、JWH133（CB2受体激动剂）+MPP+组、AM630（CB2受体抑制剂）+JWH133+MPP+组。应用免疫印迹法（Western Blot）检测Control组和MPP+组细胞CB2受体蛋白的表达。应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组环氧化酶2（COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因的表达。结果与Control组相比，MPP+组的CB2受体蛋白表达上升（F=29.78，P<0.01）。与Control组比较，MPP+组COX-2和iNOS基因的表达明显上调（F=22.59、11.27，q=10.13、5.57，P<0.01）;JWH133预处理抑制MPP+诱导的COX-2和iNOS基因表达的上调（q=6.26、4.16，P<0.05）;此抑制作用可被AM630所阻断（q=5.34、5.67，P<0.01）。结论激活CB2受体可抑制MPP+诱导的原代星形胶质细胞炎症反应。

[关键词] 受体，大麻酚，CB2;大麻素受体激动剂;1-甲基-4-苯基吡啶;星形细胞;环氧化酶2;一氧化氮合酶Ⅱ型

[中图分类号] R338.2 ?[文献标志码] A ?[文章编号] 2096-5532（2020）02-0156-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.071 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0907.003.html;2020-04-18 15：26

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of cannabinoid 2 receptor （CB2 receptor） on 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP+）-induced inflammatory response in primary cultured astrocytes. ?Methods Primary cultured astrocytes were cultured and divided into Control group， MPP+ group， JWH133 （CB2 receptor agonist）+MPP+ group， and AM630 （CB2 receptor antagonist）+JWH133+MPP+ group when growing well. Western blotting was used to determine the protein expression of CB2 receptor in Control group and MPP+ group. Quantitative real-time PCR was performed to measure the mRNA expression of cyclooxygenase-2 （COX-2） and inducible nitric oxide synthase （iNOS）. ?Results Compared with Control group， the MPP+ group had significantly up-regulated CB2 receptor protein expression （F=29.78，P<0.01） and significantly up-regulated COX-2 and iNOS mRNA expression （F=22.59，11.27;q=10.13，5.57;P<0.01）. JWH133 pre-treatment significantly inhibited the up-regulated mRNA expression of COX-2 and iNOS induced by MPP+ （q=6.26，4.16;P<0.01）， while this was blocked by CB2 receptor antagonist AM630 （q=5.34，5.67;P<0.01）. ?Conclusion Activation of CB2 receptor can inhibit MPP+-induced inflammatory response in primary cultured astrocytes.

[KEY WORDS] receptor， cannabinoid， CB2; cannabinoid receptor agonists; 1-methyl-4-phenylpyridinium; astrocytes; cyclooxygenase 2; nitric oxide synthase type Ⅱ

星形膠质细胞是中枢神经系统中数量最多的一类神经胶质细胞，它们在维持细胞外液动力学、调节神经递质代谢、促进神经再生和修复中起重要的作用[1]，在帕金森病（PD）的发生发展中也具有重要作用[2]。PD是一种常见的神经变性疾病，其病理特征为黑质致密部多巴胺（DA）能神经元的选择性缺失[3]。神经炎症则是PD神经变性的主要因素之一[4]。在病理情况下，过度活化的星形胶质细胞释放一系列炎性递质，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、环氧化酶2（COX-2）[5]和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等，可以引起神经炎症[6]，并激活小胶质细胞继续释放炎性递质加重神经炎症，从而诱导神经元死亡[7-8]。因此，有效抑制星形胶质细胞的活化和炎性因子的释放对于PD的治疗有重要意义。大麻素Ⅱ型受体（CB2受体）是一种G蛋白耦联受体[9]，大量研究表明CB2受体在中枢神经系统疾病的发病中起重要作用[10-11]。关于CB2受体治疗神经炎症反应的研究已经取得了一定进展。有研究证实，WIN55、212-2（合成CB1/2受体激动剂）和JWH133（选择性CB2受体激动剂）[12]通过激活小胶质细胞CB2受体抑制脂多糖[13]和β-淀粉样蛋白[14]诱导的TNF-α和一氧化氮（NO）的产生;在动物实验中激活胶质细胞CB2受体可以通过抑制炎症反应来保护DA能神经元[15-16]。CB2受体不仅在小胶质细胞中表达，在星形胶质细胞和神经元中也有表达[17]，但目前缺少关于星形胶质细胞中CB2受体的研究。目前尚不清楚JWH133能否通过选择性激活CB2受体抑制星形胶质细胞的炎症反应。本研究应用1-甲基-4-苯基-吡啶离子（MPP+）制备原代星形胶质细胞的炎症模型，观察JWH133对MPP+诱导的COX-2和iNOS基因表达的影响，以及CB2受体拮抗剂AM630的阻断效应，确定JWH133激活星形胶质细胞CB2受体是否具有抗炎作用，从而为PD的治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

二甲基亚砜（DMSO）、MPP+购自美国Sigma-Aldrich公司;DEMED/F12培养液购自美国Hyclone公司;青霉素/链霉素溶液购自索莱宝公司;CB2受体激动剂JWH133和抑制剂AM630购自美国Tocris Bioscience公司，用DMSO溶解制成储备溶液（1 mmol/L）置于-20 ℃储存，使用时用培养液稀释至工作浓度;兔源CB2受体抗体购自英国Abcam公司;兔源GAPDH抗体购自博奥森生物技术有限公司;HRP标记山羊抗兔IgG购自联科生物技术有限公司;TRIzol购自南京诺唯赞生物科技有限公司;PCR逆转录试剂盒和SYBR Green购自abm公司;新生SD大鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 细胞培养及分组

取新生24 h SD大鼠中脑，将其置于DEMED/F12基础培养液中，除去脑膜和血管，用1 000、200、10 μL枪头轻轻吹打使其呈浑浊离散状态，收集至大离心管中。离心，弃上清，加入含体积分数0.10胎牛血清、20 g/L青霉素/链霉素的DEMED/F12培养液，吹打混匀后将细胞接种到培养瓶中，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中差速黏附处理（倒置放置）30 min，隔天更换新鲜培养液培养7 d以上，待细胞长满瓶底90%以上时，置于37 ℃摇床中以210 r/min振荡16～18 h除去其他胶质细胞，更换新鲜培养液，用胰酶消化法收集细胞，采用特定星形胶质细胞标记物（GFAP）的免疫荧光染色进行鉴定，星形胶质细胞纯度≥95%，进行下一步实验。将原代培养的星形胶质细胞分为Control组（A组）、MPP+组（B组）、JWH133+MPP+组（C组）和AM630+JWH133+MPP+组（D组）。 Control组正常培养;MPP+组加入200 μmol/L的MPP+孵育24 h;JWH133+MPP+组用1 μmol/L JWH133预处理40 min，然后加入200 μmol/L MPP+共孵育24 h;AM630+JWH133+MPP+组用1 μmol/L JWH133和1 μmol/L AM630预处理40 min，然后加入200 μmol/L MPP+共孵育24 h。

1.3 免疫印迹法（Western Blot）检测CB2 受体蛋白的表达

Control组和MPP+组星形胶质细胞经处理后，吸净培养板中的培养液，每孔加入100 μL的裂解液（RIPA裂解液∶PMSF=99∶1），冰上裂解30 min。刮下底部的蛋白置于相应的EP管中，在4 ℃下以12 000 r/min离心20 min，取上清80 μL，用BCA法测定蛋白浓度。每组蛋白的上样量为20 μg，电泳（电压为80 V和120 V）后将蛋白转移至PDVF膜上（转膜电流为300 mA）。用50 g/L BSA封闭液封闭1 h，然后将PDVF膜放入CB2受体一抗溶液中，置4 ℃摇床上孵育过夜。次日用TBST清洗3次，每次10 min，将PDVF膜放入二抗中，室温孵育1 h，重复TBST 清洗。使用ECL显色液处理进行显影。目的蛋白的表达以CB2受体与GAPDH灰度值的比值表示。实验重复5次，取平均值。

1.4 实时荧光定量PCR（PT-PCR）检测COX-2和iNOS mRNA水平

本文4组星形胶质细胞经处理后，采用TRIzol法提取总RNA，将每个样品在1 000 μL TRIzol试剂中匀浆以纯化总RNA，使用反转录试剂盒对2 μg的总RNA进行反转录：加入AccuRT反应混合物（4×）和DEPC水，使总体积达到8 μL，42 ℃变性2 min;加入12 μL的反应体系（内含AccuRT反应混合物终止液2 μL、多合一RT Master Mix（5×）4 μL、DEPC水6 μL） 25 ℃作用10 min，继以42 ℃作用15 min逆转录合成cDNA。采用SYBR Green染料法定量检测COX-2和iNOS的基因表达[18]。大鼠原代星形胶质细胞RT-PCR扩增引物及其序列见表1。采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。实验重复5次，取均值。

1.5 统计学分析

应用Graphpad Prism 5.0软件进行统计学分析，实验所得数据以±s表示，两组间比较采用F检验，多组间的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），然后用Turkey法进行组间两两比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 ?果

2.1 MPP+处理对原代星形胶质细胞CB2受体蛋白表达的影响

Control组和MPP+组CB2受体蛋白相对表达量分别为0.80±0.08和1.12±0.08，两组比较差异有统计学意义（F=29.78，P<0.01）。表明MPP+处理可以上調原代星形胶质细胞CB2受体蛋白的表达，提示炎症时星形胶质细胞CB2受体表达增多。见图1。

2.2 JWH133对MPP+诱导的原代星形胶质细胞COX-2和iNOS基因表达的影响

与Control组相比，MPP+组COX-2和iNOS基因表达明显上调（F=22.59、11.27，q=10.13、5.57，P<0.01）;JWH133+MPP+组细胞COX-2和iNOS基因表达水平较MPP+组均明显降低，差异均具有统计学意义（q=6.26、4.16，P<0.05）;而JWH133的抗炎作用可被AM630阻断，AM630+JWH133+MPP+组COX-2和iNOS基因表达水平较JWH133+MPP+组明显升高，差异有统计学意义（q=5.34、5.67，P<0.01）。见表2。

3 讨 ?论

大麻素系统包括内源性大麻素、大麻素受体以及内源性大麻素的合成酶和降解酶。大麻素受体包含大麻素Ⅰ型受体（CB1受体）和CB2受体[7]。大麻素受体与G蛋白耦联，通过抑制腺苷酸环化酶和电压门控钙通道（例如N型、P/Q型和L型钙电流）介导信号转导[9]，激活有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和向内整流钾离子通道[19]。与CB1受体调节相比，CB2受体的激活已经被证明没有精神副作用[20]。近年来关于激活CB2受体对神经退行性疾病具有保护作用的研究日渐增多，尤其是针对它的抗炎作用，已有大量研究证据支持CB2受体可以通过参与抑制炎症反应而起到神经保护作用[21-22]。GMEZ-GLVEZ等[23]发现，使用HU-308（一种CB2受体激动剂）激活CB2受体可以抑制脂多糖诱导的纹状体和黑质中炎性因子（例如iNOS）的表达。CHUNG等[16]的研究表明，使用大麻素受体激动剂WIN55、212和JWH133激活CB2受体，可以调节1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小胶质细胞活化和炎性因子的表达，从而防止PD小鼠模型中黑质纹状体DA能神经元的死亡。TAO等[24]于2016年发现，JWH133激活CB2受体可以通过促进小胶质细胞表型从M1转至M2，显著抑制炎性因子的释放[25]，从而对神经炎症产生影响。JWH133是一种选择性CB2受体激动剂，对CB2受体的选择性是CB1受体的200倍，对CB2受体具有很高的亲和力[11]。本课题组在前期工作中已显示，JWH133激活CB2受体具有对抗MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡和神经毒性的作用。关于CB2受体起到的神经保护作用，人们更关注的是CB2受体在小胶质细胞中的抗炎作用，或者CB1/CB2受体在中枢神经系统中的协同工作[26]。但是最近有研究通过免疫组织化学实验分析显示，在PD病人脑中黑质区CB2受体与星形胶质细胞共定位，而不与其他神经胶质细胞或神经元共定位[27]。而且与正常对照组相比较，在PD病人中枢神经系统炎症状态下，星形胶质细胞CB2受体的表达急剧增加[28]。星形胶质细胞在PD进程中炎症所导致的神经元功能障碍和死亡中起关键的作用[28-29]，活化的反应性星形胶质细胞释放炎性因子（如IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS）以及活性氧的产生增加[30]，会加剧炎症过程，促进PD的发生[7，31]。而抑制活化的星形胶质细胞释放炎性因子将会对PD起到一定的改善作用。

MPP+是MPTP的有毒代謝产物，它可以激活神经胶质细胞、神经元和肥大细胞释放神经炎性递质[32]。本实验应用MPP+制备原代星形胶质细胞炎症模型。Western Blot检测结果显示，MPP+作用于原代星形胶质细胞可引起CB2受体蛋白表达的升高，表明炎症时星形胶质细胞CB2受体表达增多。为了检测CB2受体表达增多是否具有抗炎作用，本研究使用选择性CB2受体激动剂JWH133来激活CB2受体，然后通过检测炎性因子COX-2和iNOS的基因表达水平，探讨JWH133对炎症反应的作用。COX-2是生成前列腺素的关键酶，iNOS可催化生成NO，它们对神经元具有毒性作用，参与并诱导神经炎症，导致神经元细胞死亡[33]。本实验研究结果显示，使用1 μmol/L的JWH133对原代星形胶质细胞进行预处理，能够有效抑制MPP+诱导的COX-2和iNOS基因表达上调，表明选择性激活CB2受体对原代星形胶质细胞具有明显的抗炎作用。进一步使用1 μmol/L的AM630进行验证，结果显示其能够阻断JWH133的抗炎作用。

综上所述，本实验初步证明JWH133激活CB2受体能抑制MPP+诱导的原代星形胶质细胞的炎症反应，抑制COX-2和iNOS基因的表达，其抗炎作用可以被AM630所阻断。本文结果为通过激活CB2受体抑制星形胶质细胞神经炎症从而治疗PD提供了新的方案[34]，但还需要进一步研究其所涉及的机制。

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（本文編辑马伟平）

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