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不同疏水层析填料分离纯化重组抗IL-6人源化单克隆抗体效果的比较

范文

李子财阳燕陈发平

摘要：疏水层析是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，因此可以用来分离纯化目的蛋白，去除聚体、HCP、rProteinA等杂质[1]。

关键词：疏水层析，疏水层析填料，SEC-HPLC纯度，HCP，得率

【中图分类号】R-3 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）04-008-01

一.背景介绍

疏水层析填料配基疏水性由弱到强的顺序为：乙醚（Ether），聚丙二醇（PPG），苯基（Phenyl），丁基（Butyl），己基（Hexyl）[2]。Hexyl和Butyl常用来分离低疏水性的蛋白。实验中选取了不同厂家的三种疏水层析填料，其中厂家不同的Phenyl BeStaroSe 6 FaSt Flow填料和TOYOPEARL Phenyl-600M填料都是交联琼脂糖为支持物，交联琼脂糖支持物与苯基（Phenyl）共价结合。TOYOPEARL Butyl-600M填料的疏水基团为丁基（Butyl）。

疏水层析缓冲液体系中高离子强度可以增强蛋白质与疏水性层析介质之间的疏水作用。利用这个性质，在高离子强度下将待分离的目的蛋白吸附在疏水性层析介质上，大部分亲水性的杂质在上样和平衡的过程中流穿，然后通过线性洗脱的方式，降低离子强度，选择性的将目的蛋白洗脱下来。疏水性弱的物质，在较高离子强度的溶液时被洗脱下来，当离子强度降低时，疏水性强的物质才随后被洗脱下来，从而得到分离去除杂质的效果[3]。

二.实验方法

1.实验材料

层析柱：MilliPoreVL11×250mm

层析填料：Phenyl BeStaroSe 6 FF、TOYOPEARL Butyl-600M、TOYOPEARL Phenyl-600M

层析系统：GE AKTAPurifier 100

蛋白样品：来自于CHO细胞培养产物纯化中间体

①阴离子交换层析浓缩后样品

②阴离子交换层析后样品

2.实验步骤：

（1）考察样品在不同浓度硫酸铵的稳定性，摸索实验最佳缓冲液条件

将样品①与3 M硫酸铵、0.25 M 磷酸盐缓冲液（PH6.8）、纯化水相互混合，分别配制成浓度为0.5至1.0 M的硫酸铵溶液，每管体积为10 mL。观察样品在不同硫酸铵浓度下的澄清状态，是否析出。

（2）考察不同疏水填料对杂质的去除效果和得率，选择合适的疏水填料。

选取三种疏水层析填料进行对比实验。平衡液为0.7 M硫酸铵25 mM 磷酸盐缓冲液（PH6.2±0.2），将样品②以10%乙酸和3 M硫酸铵调节至PH6.2±0.2电导率100±15 mS/cm。三种填料分别装成I.D.1.1×20 cm（20 mL）规格的层析柱，上样载量为20 mg/mL，流速为180cm/h，0-100% 10个柱体积线性梯度洗脱。从洗脱峰UV吸收值>300 mAU（UV280nm）开始收集，至UV吸收值<300 mAU（UV280nm）时结束收集。样品送检SEC-HPLC纯度、HCP。

三.实验结果

1.样品在不同浓度硫酸铵中的稳定性

实验结果见表1。根据数据，初步计划后期疏水层析实验使用的上样样品及平衡液的硫酸铵浓度上限为0.7M，PH范围为6.0-6.4。

2.不同疏水填料对杂质的去除效果比较

从三种填料的层析图谱峰型能看出三种填料均能很好的和目的蛋白结合，在合适的洗脱条件下能成功的将目的蛋白洗脱下来。由表2可见，上样样品蛋白本身纯度較高，经过上样样品PH和电导调节，以及疏水层析后蛋白纯度没有降低，说明此工艺对蛋白纯度无影响。综合考虑得率、HCP的去除效果，最终选用TOYOPEARL Butyl-600M填料作为该目的蛋白的疏水层析填料。

四.结论

三种疏水层析填料均有较好的去除HCP的效果，综合得率和HCP去除效果，最终选择疏水基团为丁基（Butyl）的TOYOPEARL Butyl-600M填料作为目的蛋白的疏水层析填料。

五.参考文献

[1]《生物化学》王镜岩

[2]疏水相互作用填料 TOSOH BioScience

[3]俞俊棠等.新编生物工艺学（下册）：化学工业出版社，2003年06月第1版

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