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标题

不同浓度miR-155mimics和miR-155 inihibitor在足细胞中的转染效果

范文

凌霄雁林栩郑心彤古贤君梁钊覃卿杜秀日

【摘要】目的?探討瞬时转染miR-155mimics和miR-155 inihibitor化学合成物在足细胞中表达变化及其稳定情况。方法?体外培养小鼠肾小球足细胞，用脂质体法将miR-155mimics/NC、miR-155 inihibitor/NC、Cy3 miR-155 mimics/inhibitor NC转染足细胞，构建足细胞内miR-155高表达模型、低表达模型、荧光基团。然后用免疫荧光显微镜观察不同剂量LipofectamineTM 2000转染不同浓度Cy3 miR-155 NC后的荧光转染效果。用实时荧光定量PCR 技术检测足细胞中miR-155mimics浓度梯度（50、80、100 nmol/mL）、miR-155 inihibitor浓度梯度（80、100、150 nmol/mL）的miRNA-155表达。结果?达到一定剂量的LipofectamineTM 2000足以饱和不同浓度的miRNA，并将不同浓度Cy3 miR-155 NC成功转入足细胞内，且转染效率达80%以上。qRT-PCR结果显示转染miR-155mimics、miR-155 inihibitor 24 h后，miR-155在足细胞中的表达明显改变，与阴性对照组（NC）比较差异有统计学意义，表明转染成功。转染80 nmol/mL浓度的miR-155mimics，miR-155在足细胞中的表达明显上调（P<0.001），与其他浓度对比表达量升高，差异有统计学意义。转染150 nmol/mL浓度的miR-155 inihibitor，miR-155在足细胞中的表达明显下调（P<0.001），与其他浓度对比表达量降低，差异有统计学意义。结论?LipofectamineTM 2000达到适当剂量时将各工作浓度的miRNA-155转入足细胞内的转染效果高。80 nmol/mL的miR-155mimics和150 nmol/mL的miR-155 inhibitor可能较适合用于实验研究。

【关键词】足细胞;miR-155 mimics;miR-155 inihibitor;LipofectamineTM 2000

中图分类号：R329.2+6?文献标志码：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.002

【Abstract】Objective?To investigate the expression and stability of transiently transfected miR-155mimics and miR-155 inhibitor chemical compounds into podocytes.Methods?Mouse glomerular podocytes were cultured in vitro，and miR-155 mimics/NC，miR-155 inhibitor/NC，Cy3 miR-155 mimic/inhibitor NC were transfected into podocytes by liposome method to construct miR-155 high expression model or low expression model and fluorophore in podocytes.The transfection effect of different doses of LipofectamineTM 2000 transfecting different concentrations of Cy3 miR-155 NC was observed by immunofluorescence microscopy.miRNA-155 expression transfected with miR-155 mimics at concentration gradient （50，80，100 nmol/mL） or miR-155 inhibitor at concentration gradient （80，100，150 nmol/mL） in podocytes was detected by qRT-PCR.Results?A fixed dose of LipofectamineTM 2000 was sufficient to saturate different concentrations of miRNA，and different concentrations of Cy3 miR-155 NC were successfully transferred into podocytes，and the transfection efficiency was over 80%.qRT-PCR results showed that the expression of miR-155 in podocytes was significantly changed after transfection of miR-155 mimics or miR-155 inhibitor for 24 h，and the difference was statistically significant compared with the negative control group（NC），indicating a successful transfection.When transfected with miR-155mimics at a concentration of 80 nmol/mL，the expression of miR-155 in podocytes was significantly up-regulated compared with other concentrations（P<0.001）.And when transfected with miR-155 inhibitor at 150 nmol/mL，miR-155 expression in podocytes was significantly down-regulated?compared with other concentrations（P<0.001）.Conclusion?With appropriate dose of LipofectamineTM 2000，the transfection efficiency of working concentration of miRNA-155 into podocytes is high.Concentrations of 80 nmol/mL miR-155 mimics and 150 nmol/mL miR-155 inhibitor may be suitable for experimental studies.

【Key words】podocyte;miRNA-155 mimics;miRNA-155 inihibitor;LipofectamineTM 2000

微小RNA（miRNA）是一种内源性小分子非编码RNA，在生物生长发育，细胞增殖、分化、凋亡及疾病发生中发挥至关重要的作用。其作用机理是与靶基因完全或部分互补结合，从而在转录后对靶基因水平实行负性调节。miRNA在不同肾脏疾病如肾病综合征、糖尿病肾病、IgA肾病、狼疮性肾炎、多囊性肾病和移植排斥反应等具有特异性的表达谱[1]。足细胞即肾小球脏层上皮细胞，是一种高度特异、终末分化、位于基底膜最外层的上皮细胞，与基底膜、肾小球内皮细胞共同构成肾小球滤过屏障。足细胞的结构和功能与微小病变肾病、局灶节段性肾小球硬化（FGSG）、膜性肾病、糖尿病肾病、系统性红斑狼疮性肾炎等肾小球疾病的发生发展机理密切相关[2]。我们之前用转化生长因子β1（TGF-β1）诱导足细胞损伤模拟肾病模型，发现miRNA-155表达上升[3]，但miRNA-155是否在足细胞损伤中起着调节作用尚不清楚，因此，本实验旨在通过瞬时转染不同浓度miR-155mimics和miR-155 inihibitor化学合成物，目的是筛选出适合今后实验的化学合成物浓度，实现稳定的足细胞miRNA-155高表达和低表达，以期为进一步深入研究miRNA-155在足细胞损伤的作用奠定基础。

1?材料与方法

1.1?材料

肾小球足细胞株（MPC5）购于上海复旦大学细胞中心，RPMI1640培养基（美国Gibco）、胎牛血清（以色列BI-04-002-1A），LipofectamineTM 2000（invitrogen），miR-155mimics/mimics NC、miR-155 inihibitor/inhibitor NC、Cy3 miR-155 mimic/inhibitor NC均购买于广州锐博公司，RNAiso Plus RNA 提取试剂盒（日本TaKaRa 9108），Mir-X miRNA FirstStrand Synthesis Kit（美国clontech 638315），SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本TaKaRa，RR820A），miRNA-155 Forward primer由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1（miRNA mRQ 3primer由TaKaRa公司提供，为其专利，不提供具体碱基序列）。

1.2?足细胞培养

培养方法参考本课题组的前期研究，稍作修改[4]。细胞复苏后，每2～3 d换液1次，细胞融合至80%左右消化传代，在含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液，37℃、5% CO2培养箱中培养。14 d左右分化成熟后用于后续实验。

1.3?实验分组

细胞传代后，以0.4×105～1×105个对数生长期细胞种于24孔板或6孔板中，待各组细胞融合至50%～70%后用含1%胎牛血清的RPMI1640培养液同步化24 h。参照说明书化学合成miRNA工作浓度范围10～200 nmol/mL，将Cy3 miR-155 mimic/inhibitor NC分五组浓度梯度（50、80、100、120、150 nmol/mL）、miR-155mimics/mimics NC分三组浓度梯度（50、80、100 nmol/mL）、miR-155 inihibitor/inhibitor NC分三组浓度梯度（80、100、150 nmol/mL）。同时根据转染试剂LipofectamineTM 2000的用量分组，miRNA∶LipofectamineTM 2000用量比值为1∶0.01～1∶0.1（pmol∶μL）。或Cy3 miR-155 NC、miR-155mimics/mimics NC、miR-155 inihibitor/inhibitor NC为以上浓度不变，而LipofectamineTM 2000在24孔板用量为1.5 μL，6孔板用量为7.5 μL，具体分组详见表2。

1.4?细胞转染

分別将Cy3 miR-155 NC、miR-155 mimics/mimicsNC、miR-155inihibitor/inhibitor NC、脂质体LipofectamineTM 2000加入相应剂量的OPTI-MEM培养基中静置5 min，然后与LipofectamineTM 2000一一对应混匀，室温静置20 min后分别加入24孔板或6孔板中，孵育4～6 h后改用含10% FBS的RPMI-1640培养基，37℃、5% CO2培养箱中继续培养至24 h。

1.5?miRNA-155荧光转染效率的测定

24小时后通过免疫荧光倒置显微镜观察计数表达红色荧光的细胞，扫描采集图像。随机取3个高倍镜视野，计算每个视野下表达红色荧光的细胞数占总细胞数的百分比（转染细胞率=荧光表达细胞数/总细胞数×100%），取其平均值作为转染效率。

1.6?Real-time RT-PCR检测miRNA-155表达

按照RNAiso Plus说明书提取各实验组小鼠足细胞的总RNA。经紫外分光光度计测定OD260、OD280及RNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取1 μg总RNA反转录合成cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。使用LightCycler96实时荧光定量PCR仪进行检测。选取U6作为miRNA的内参，检测miR-155、U6的mRNA表达。以2-△△CT法计算相对表达量，ΔΔCT=（CT实验组目的-CT实验组内参）-（CT对照组目的-CT对照组内参）。

1.7?统计学方法

采用SPSS 20.0 进行统计分析，符合正态分布的资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），两两比较用LSD-t 检验。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2?结?果

2.1?足细胞转染情况

在24孔板中将1.5 μL LipofectamineTM 2000和Cy3 miRNA-155 mimic/inhibitor NC或按照1∶0.01～1∶0.1（pmol∶μL）比值（表2）转入足细胞中，24 h后在荧光倒置显微镜下检测其转染的荧光图，发现转染比值为20/1时，即Cy3用量与LipofectamineTM 2000一致时，足细胞的胞质中出现了明显的荧光（图1B，D），其他比值LipofectamineTM 2000用量大于等于1.5 μL时，足细胞也出现了较明显的荧光（图1F，H，J），并且荧光效率都能达到80%以上。而LipofectamineTM 2000用量小于1.5 μL时，足细胞只见散在的荧光点，胞质中没有出现明显的荧光（图2B，D），未转染的足细胞是没有荧光的。在6孔板中将7.5 μL LipofectamineTM 2000与Cy3 miRNA-155mimic/inhibitor NC转入足细胞中，24 h后在荧光倒置显微镜下检测其转染的荧光，如图3所示：转染Cy3 miRNA-155 NC后的足细胞的胞质中出现了明显的荧光（图3B，D），并且荧光效率都能达到80%以上。而未转染的足细胞是没有荧光的。

2.2?miR-155mimics转染足细胞后引起miR-155水平升高

将不同浓度miR-155mimics和miR-mimics NC分别转入足细胞中，24 h后收集细胞，提取RNA，用实时荧光定量PCR检测各组细胞内miR-155的表达。如图4所示：与miR-mimics NC相比，miR-155mimics转染后miR-155水平显著上调（P<0.001），且转染浓度为80 nM的miR-155 mimics上调最为明显，差异有统计学意义（P<0.001）。

2.3?miR-155 inhibitor转染足细胞后引起miR-155水平降低

将不同浓度miR-155 inhibitor和miR-inhibitor NC分别转入足细胞中，24 h后收集细胞，提取RNA，用实时荧光定量PCR检测各组细胞内miR-155的表达。如图5所示：与miR-inhibitor NC相比，miR-155 inhibitor转染后miR-155水平显著下调（P<0.001），且转染浓度为150 nM的miR-inhibitor，细胞miR-155的RNA下降水平低于浓度为80 nM和100 nM的miR-inhibitor，差异有统计学意义（P<0.001，P=0.001）。

3?讨?论

微小RNA（miRNA）几乎参与所有细胞功能的调控，肾脏发育过程中需要miRNA的活性调节，作为调节肾脏的病理生理基因表达的小分子非编码RNA，在肾脏健康和疾病中起着关键作用[5]。近年来miRNA在足细胞中的表达和功能分析取得了进展，甚至可能成为疾病生物标志物和治疗的重要靶点。在膜性肾病（MN）中，检测到七种足细胞特异性miRNA，例如特异性肾连蛋白（nephronectin，NPNT）的miR-378a，Müller-Deile等人[6]发现 miR-378a-3p可抑制基底膜中足细胞衍生的细胞外基质蛋白NPNT的表达水平，引起足细胞损伤。Ramezani等人[7]提取FGSG患者尿液的外泌体miRNA，检测发现miR-155水平上调。Beltrami等[8]在糖尿病肾病患者尿液中也发现miR-155水平表达明显增加，认为其可成为生物标志物。在狼疮性肾炎患者的血浆中，Zununi等[9]发现 miR-155水平显著增加，可能提示炎症反应活动期，且与炎症介导的肾小球内皮损伤和纤维化相关。

足细胞是肾小球滤过屏障不可缺少的重要部分，它的损伤涉及人类许多肾脏疾病，因此miR-155成为肾小球疾病的生物标志物前景是可预见的。我们课题组前期研究结果已经表明miRNA-155在足细胞损伤中的表达变化[3]，然而miR-155在足细胞中的功能如何，其参与足细胞损伤的具体机制不详，这是我们今后所研究的方向。

micrONTM miRNA mimic是一种化学合成的miRNA 模拟物，模拟细胞中成熟miRNA 的高水平表达，使内源miRNA的调控作用增强。micrOFFTM miRNA inhibitor也是化学合成经特殊修饰的miRNA抑制剂，通过特异性结合成熟miRNA分子而抑制细胞中miRNA对靶基因的调控作用。作为专门用于miRNA功能研究的化学合成物，它们更容易控制转染工作浓度，操作方便快捷，高效能且可以缩短实验周期，因此miRNA mimic和 miRNA inhibitor是瞬时转染较为理想的选择，国内外应用都很广泛。然而在国内外文献中发现，许多不同miRNA，甚至同个miRNA，miRNA mimic和 miRNA inhibitor用于实验的工作浓度并不一致，文献也并没有阐明选择的理由。miRNA mimic和 miRNA inhibitor在不同的生产来源有一定的差异，在不同的细胞中表达功能也不完全一致，转染试剂和方法也有所不同。

在动脉粥样硬化泡沫细胞[10]中使用转染试剂Lipofectamine?LTX & Plus转染100 nmol/mL miR-155mimic或miR-155 inhibitor，并在不同時间梯度检测miR-155的有效表达量。在心肌细胞中，有文献选择miR-155 mimic工作浓度为50 nmol/mL，使用X-treme GENE siRNA转染试剂进行瞬时转染[11]。在我们的实验中，首先使用转染成功指示剂Cy3 miR-155 NC对化学合成物miRNA在足细胞中的转染效果进行初步观察。根据说明书miRNA mimic起始工作浓度为50 nmol/mL，miRNA inhibitor为100 nmol/mL，并参考文献，将Cy3 miR-155 NC分为不同浓度梯度，同时根据miRNA公司推荐转染试剂LipofectamineTM 2000的用量进行分组，miRNA∶LipofectamineTM 2000用量比值为1∶0.01～1∶0.1（pmol∶μL），或根据LipofectamineTM 2000公司推荐，24孔板用量为1.5 μL和6孔板用量为7.5 μL进行分组。在24孔板中转染24 h后，免疫荧光显微镜观察表明转染时LipofectamineTM 2000要达到一定适当的量，才能饱和不同浓度的miRNA，将Cy3 miRNA-155 NC成功转入足细胞内。6孔板中转染实验再次验证LipofectamineTM 2000只有达到适当的剂量才足以将各工作浓度的miRNA-155成功转入足细胞内，并且荧光效率能达到80%以上。接着我们按照以上试剂用量及实验方法，用qRT-PCR检测miR-155的表达量变化情况，结果显示转染不同浓度miR-155 mimic，miR-155在足细胞中表达均上调显著，转染不同浓度miR-155 inhibitor后，miR-155表达也均明显下调。研究结果表明miR-155mimi和miR-155 inhibitor在足细胞中转染成功，并且浓度80 nmol/mL miR-155mimic的miR-155表达上调比其他两个浓度高，浓度150 nmol/mL miR-155 inhibitor 的miR-155表达下调比其他两个浓度低，这两个工作浓度可能较适合用于我们的实验研究。

有研究者使用LipofectamineTM 2000转染30 nmol/mL和50 nmol/mL两个浓度的miR-30 inhibitor入足细胞[12]，结果显示浓度50 nmol/mL即对靶基因有明显作用。在本实验中，我们选择化学合成物，对其进行浓度、剂量摸索，为后期的实验做好准备，后期我们将对转染时间和对靶蛋白的作用予进一步的研究。

参?考?文?献

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（收稿日期：2019-10-11?修回日期：2019-11-14）

（編辑：王琳葵?梁明佩）

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