| 标题 | iNOS基因rs10459953/rs1060822多态性与低氧训练效果的关联性研究 |
| 范文 | 毛颖颖 汪洪波 刘海平 摘要：目的：选取低氧反应基因——诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase， iNOS）基因序列上rs10459953、rs1060822单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）位点，研究其与低氧训练后生理表型指标关联性。方法：采用关联研究方法（Association-Study），聚合酶链反应-限制片段长度多态性（PCR-RFLP）实验解析技术，选取35名健康受试者在模拟海拔2500 m高度进行4 周高住-高练-低训（living high-exercise high-training low， Hi-Hi-Lo）。研究iNOS基因SNP rs10459953和SNPrs1060822与低氧训练后最大摄氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、血红蛋白（hemoglobin， Hb）、红细胞数（red blood cell， RBC）等生理表型指标关联性。结果：1）4周低氧训练后，SNP rs10459953不同基因型之间VO2max 、Hb、RBC变化量均无显著性差异。2）4 周低氧训练后，SNP rs1060822不同基因型间Hb、RBC变化量有统计学意义（P<0.05），其中CT 基因型受试者Hb、RBC显著增加（P<0.05），且在低氧环境下定量负荷实验中，SNP rs1060822 的CT基因型受试者低氧训练后期SpO2动态曲线显著高于初期（P<0.05）。结论：iNOS基因 SNP rs1060822与低氧训练后血象指标存在一定关联性，CT基因型表现出一定优势。 关键词：诱导型一氧化氮合酶；单核苷酸多态性；低氧训练 中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1006-2076（2014）01-0085-05 低氧训练能提高耐力项目运动员的有氧运动能力，这已被国内外学者所认同。但由于个体对低氧生理反应的差异性，会产生不同的低氧训练适应效果[1]，且低氧训练效果差异性与遗传学因素有关。Pasha 等证实，高原病的易感率以及人类对低氧环境的适应能力与相关低氧反应基因多态性有关[2-3]。 山东体育学院学报第30卷第1期2014年2月 毛颖颖，等iNOS基因rs10459953/rs1060822多态性与低氧训练效果的关联性研究No.1 2014 一氧化氮合酶（nitric oxide synthase ， NOS）在体内的主要生物学作用是催化L2精氨酸氧化生成一氧化氮（nitric oxide ， NO），NO是一种可在细胞间自由扩散的信使分子，参与心血管、免疫和神经系统功能的调节。大量研究证实，NOS活性增强，促进生成的NO可促进运动过程中葡萄糖转运至骨骼肌，改善运动肌内血流量[4-5]。此外，iNOS基因启动子上有一段与低氧反应增强子（Hypoxia-Responsive Enhancer， HRE） 同源的序列，因此，iNOS表达可对细胞感受低氧调节发挥一定作用[6]。因此，iNOS基因多态性可能与低氧训练适应遗传因素有关。 本研究选取iNOS基因5端非编码区的SNP rs10459953和第20外显子2622bp处的SNP rs1060822 两位点，研究其与低氧训练后生理表型指标的关联性，以探寻低氧训练个体差异性的遗传学标记。 1对象与方法 1.1受试对象 本研究选取35名健康受试者（男性23名，女性12名），平均年龄19.54±2.55岁，平均身高177.94±4.27 cm，平均体重68.07±5.579 kg，均系中国北方汉族健康人群，无低氧暴露经历。 1.2低氧运动方案 受试者居住于常压低氧环境，每天晚上20：00至次晨6：30在氧浓度为15.4%低氧房内（相当于海拔2500 m）休息和睡眠，低氧暴露时间≥10 h/天，白天在海拔50 m的常氧环境下学习生活，共进行4周实验。低氧实验期间，进行每周3次，每次30分钟的蹬功率自行车低氧定量负荷运动，以基础VO2max70%强度为运动负荷，功率自行车转速为60转/分。 1.3测试方案 1.3.1生理指标测试 生理指标测试：低氧实验前后分别进行1次最大摄氧量（maximal oxygen uptake， VO2max）、血象指标（hematological parameters）、低氧定量负荷实验下血氧饱和度（oxygen saturation， SpO2）的测试。VO2max测试采用递增负荷实验进行，起始负荷60 W，功率车转速为60 RPM，每3分钟递增30 W，直至力竭，VO2max判定标准以心率超过180 b/min，呼吸商超过1.1，VO2不再增加，受试者不能保持蹬车频率等因素综合确定；血象指标测试是受试者晨空腹取静脉血0.5 ml，采用BECKMAN STKS型全自动血细胞分析仪进行测试分析，主要包括红细胞（RBC）、血细胞压积（Hct）、血红蛋白（Hb）等；SpO2采用定量负荷实验，即受试者在15.4%O2低氧环境下，以70%基础VO2max强度进行蹬功率自行车，功率自行车转速为60 RPM，持续运动时间21min，记录安静时、运动中每3min及恢复期间1min、3min的SpO2。 1.3.2基因多态性分析 取静脉血2 ml，2% EDTA抗凝，用promega公司全血总DNA提取专用试剂盒提取受试者DNA，对iNOS基因SNP rs10459953及rs1060822进行分析。 1.3.2.1iNOS基因SNP rs10459953分析 依据人类iNOS基因序列，用Primer 5. 0设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5--GGAAGAAACAAAACCCTCT-3-；下游引物：5--CCTGGCAGTCACAGTCATA-3-。20 μLPCR反应体系扩增，包括：10×PCR 2 μL， 25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10mM 1 μL，上、下引物各10 pmol0.5 μL，Taq酶1 U，模板100 ng。各种药品均为上海生工产品。 扩增方案是：1）94°C预变性5 min；2）94 °C变性40 s，54 °C退火40 s，72°C延伸40 s，35 个循环；3）72°C延伸10 min。扩增产物为405 bp 片段。限制性内切酶分析：EagI 在37°C 1 h消化扩增产物，3%琼脂糖电泳，溴化乙锭（ethidium bromide， EB）染色，凝胶成像系统紫外光成像（上海天能）。 1.3.2.2iNOS基因SNP rs1060822分析 依据人类iNOS基因序列，用Primer 5. 0设计引物， 引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5--AAATGAAAGGAGGGCACA-3-；下游引物：5--CACCACTCGCTCCAGTAT-3-。20 μLPCR反应体系扩增，包括：10×PCR Buffer 2 μL，25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10 mM 1 μL，上、下引物各10 pmol0.5 μL，Taq酶2 U，模板100 ng。各种药品均为上海生工产品。 扩增方案是：1）94°C预变性5 min；2）94℃变性40 s，52℃退火40 s，72°C延伸40 s，35 个循环；3）72°C延伸10 min。扩增产物为232 bp 片段。限制性内切酶分析：AccI 在37°C 1h消化扩增产物，3%琼脂糖电泳，溴化乙锭（ethidium bromide， EB）染色，凝胶成像系统紫外光成像（上海天能）。 1.4数据处理 所有数据以±SD表示。数据统计学处理采用SPSS 11.5软件统计包（SPSS software for Windows 11.5 package）完成。受试者人群的基因型频率是否符合Hardy-weinberg遗传平衡定律采用卡方检验（chi-test）统计；低氧训练前后生理指标数据先用K-S检验是否符合正态分布，如符合进行下面统计学处理：低氧训练前、后基因型之间的生理指标差异用单因素分析（ANOVA）处理，当基因型只有两种时，采用独立样本t检验处理，组间的两两比较采用Post-Hoc处理；基因型之间生理指标的变化量采用协方差处理，以低氧训练前的初始值作为协变量进行分析，分析不同基因型受试者进行定量负荷实验时SpO2的变化差异，采用两因素重复测量方差处理（基因型X时间），基因型组同一时间点SpO2的比较，采用独立样本t检验处理。显著水平设为P<0.05。 2结果 2.1iNOS基因SNP rs10459953、rs1060822分析结果 35名受试者iNOS基因SNP rs10459953、rs1060822解析结果显示，SNP rs10459953位点中，GG基因型频率占31%，GC基因型频率占49%，CC基因型频率占20%，G等位基因频率为44%，C等位基因频率为56%。SNP rs1060822位点中，CC基因型频率占11%，CT基因型频率占83%，TT基因型频率占6%，C等位基因频率为53%，T等位基因频率为47%。卡方检验结果表明，SNP rs10459953基因型频率符合Hardy-weinberg遗传平衡，而SNP rs1060822位点不符合Hardy-weinberg遗传平衡，可能是由于样本量过少（图1）。 2.2iNOS基因SNP rs10459953与低氧训练后生理表型指标的关联变化 低氧训练前后，测试所有35名受试者VO2max、Hb、RBC 等生理生化指标，结果显示，低氧训练前，SNP rs10459953不同基因型之间最大摄氧量的绝对值存在显著性差异（P<0.05），组间两两比较结果显示，GC基因型明显高于GG基因型（3594.07±295.11 vs 3102.31±499.84 ml/min，P=0.002）；GC基因型与CC基因型相比无显著性差异；低氧训练后，各基因型组间VO2max、Hb、RBC变化均未显现统计学意义。 2.3iNOS基因SNP rs1060822与低氧训练后生理表型指标的关联变化 SNP rs1060822不同基因型实验前后生理指标变化结果见表2。低氧训练前各基因型组间VO2max、Hb、RBC 等生理表型指标无明显变化。低氧训练后，SNP rs1060822各基因型组间ΔHb、ΔRBC存在显著性差异（P<0.05），两两比较发现，CT基因型Hb增加幅度明显高于CC基因型（1.70±6.63 vs -12.36±5.85 g/L，P<0.05）；ΔRBC的组间两两比较结果显示，CT基因型增加幅度明显高于CC基因型（0.25±0.41 vs -0.28±0.32×1012/L，P<0.05）；CT基因型群体ΔHb、ΔRBC与TT基因型群体相比差异无显著性，但从升高幅度的趋势上分析，CT基因型相比具有一定优势。表2iNOS基因SNP rs1060822 C/T低氧训练后生理表型指标变化±SD 2.4低氧定量负荷实验中SpO2指标的变化 低氧训练前后，低氧环境下定量负荷实验过程SpO2动态变化结果见图2，SNP rs10459953的GG和GC基因型受试者低氧训练前后SpO2变化存在显著性差异（P<0.05），后期定量负荷实验过程中GG和GC型受试者SpO2动态曲线处于较高水平；SNP rs1060822 的CT基因型受试者低氧训练前后SpO2动态曲线变化存在显著性差异（P<0.05），后期定量负荷实验过程中SpO2动态曲线显著高于初期。 图2iNOS基因SNP rs10459953 和SNP rs1060822多态位点不同基因型受试者低氧训练前后定量负荷实验期间SpO2动态变化曲线 3讨论 NO 是体内的一种气体信号分子，它对于血管舒张，促进血液循环有明显作用[7]，且可以调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞的功能，同时也参与低氧时细胞内某些低氧敏感基因表达的调节[8]。iNOS是体内合成NO关键限速酶，在血管内皮局部受到损伤时，iNOS在严格控制下的诱导表达对于补偿内源性NO不足、恢复正常血管功能具有重要意义[9]。近年来，关于iNOS基因多态性研究多集中于临床疾病方面，与低氧训练、低氧适应效果个体差异性的研究甚少。 人体iNOS 基因位于第17 号染色体长臂（17q11.2～17q12），全长约37kb，含有26 个外显子。本研究选取的SNP rs10459953位于iNOS基因5端非编码区，该区域为一段连接第一外显子和启动子的非编码序列，虽不能编码蛋白质，但对于遗传信息的表达是必不可少，在基因转录和翻译过程中有着重要的调控作用，如①保护mRNA，防止RNA酶5-3端外切酶活性对mRNA的讲解；②增强mRNA的剪切和翻译效率；③影响翻译起始的准确性，因此，该区域多态性可能影响iNOS 基因的转录表达。从本研究结果发现，iNOS 基因SNP rs10459953虽与低氧训练前VO2max指标存在一定关联性，即GC基因型表现出一定优势，但与低氧训练后VO2max、RBC、Hb等生理指标变化并未有明显关联。关于此位点与低氧环境适应的关联研究尚未见报道，仅有临床研究认为[10]，iNOS 基因SNP rs10459953与良性前列腺增生有关。 本研究发现，SNP rs1060822位点与低氧训练后RBC和Hb指标有明显关联，CT基因型受试者在低氧训练Hb和RBC变化量明显好于其它基因型，CT基因型受试者低氧训练后Hb、RBC分别提高1.16%、5.35%，而CC、TT基因型分别降低8.39%、5.93%和1.23%、2.66%，且CT基因型受试者在低氧定量负荷实验过程中SpO2变化也具有一定优势。本研究选取的SNP rs1060822位于17号染色体长臂，iNOS基因第20外显子2622bp处，属于同义突变。同义突变是指DNA一维序列发生单个碱基的置换，但由于遗传密码子的兼并性，并不引起翻译时氨基酸的改变。传统观念认为，由于同义突变未导致氨基酸一级结构改变，就不影响蛋白质的高级结构，因而不引起蛋白质功能变化。近年来随着对基因调控区、翻译起始密码子附近区域及内含子等翻译区突变的研究逐步深入，发现同义突变虽不引起氨基酸序列的改变，但基因编码区内出现的SNP或同义突变可由于同一氨基酸对简并密码子的翻译效率不同，或转录水平的差异而导致蛋白质表达量上的改变，因此，SNP rs1060822同义突变也可能通过转录、转录后翻译及翻译后加工等多环节中的某些步骤而引起iNOS蛋白质表达量的变化。Yoneda M等[11]对于SNP rs1060822研究发现，携带T等位基因非酒精性脂肪肝受试者的肝活检标本中iNOS mRNA的表达增加，iNOS表达增加可能与机体细胞感受低氧有关，有研究报道，iNOS基因的启动子上有一段与低氧反应增强子（Hypoxia-Responsive Enhancer， HRE） 同源的序列，称iNOS-HRE，可以诱导iNOS-HRE 的活性[6]。同时，HIF-1识别iNOS-HRE并与之结合，介导低氧反应，使肾脏产生EPO增多，致使血浆、血清EPO浓度升高，并与红系祖细胞膜上EPOR结合，促进红系祖细胞由早期红系祖细胞（BFU-E）到晚期红系祖细胞（CFU-E）的增殖分化，最终形成成熟的红细胞释放入血，加强体内氧气运送，改善组织、器官氧水平。这可能是iNOS基因SNP rs1060822位点与低氧训练血象指标关联的机制。此外，SNP rs1060822 的CT基因型受试者低氧训练前后期定量负荷实验过程中SpO2动态曲线显著高于初期，也表明CT基因型受试者具有良好的低氧训练生理效果，这与血象指标变化相一致。有研究报道，低氧环境下运动时，具有较高SpO2水平的个体，其表现出较好的低氧适应及低氧运动能力[12]。但本研究并未观察到SNP rs1060822与VO2max指标关联，其原因有待于进一步研究。 4结论 低氧训练后，SNP rs1060822携带CT 基因型受试者ΔHb、ΔRBC显著增加；且在低氧训练后定量负荷实验过程中SpO2变化也表现一定优势；SNP rs10459953与个体低氧训练后生理表型指标无关联。 参考文献： [1]Suzuki K， Kizaki T， Hitomi Y，et al.Genetic variation in hypoxia-inducible factor-1alpha and its possible association with high altitude adaptation in Sherpas[J]. 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