| 标题 | 中枢疲劳恢复期大鼠海马GDNF、GFRα—1mRNA及其蛋白表达的动态变化特征 |
| 范文 | 陈万等
摘要：目的：探讨大鼠海马组织胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor， GDNF）、GDNF家族受体α-1信使RNA （GDNF？family receptor α-1mRNA，GFRα-1mRNA）及其蛋白表达在中枢疲劳后恢复期不同时相的动态变化特征。方法：雄性2月龄SD大鼠32只，随机分为对照组（C组，n=8）、实验组（E组，n=24）；E组进行7周疲劳模型运动后，又随机分为运动后即刻组（E0组，n=8）、恢复期12 h组（E1组，n=8）、恢复期24 h组（E2组，n=8）。C组正常笼养，E组进行7周递增负荷跑台训练。经7周疲劳模型运动后即刻，C组和E0组腹腔注射10%水合氯醛糖浆（03mL/100g）麻醉后取海马组织，用于测定5-羟色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、多巴胺 （dopamine， DA）、GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达；E1组和E2组分别在恢复期12 h、24 h做上述同样取材和测试。结果：1）大鼠经7周递增负荷跑台训练后即刻，海马组织5-HT升高（P<001），DA下降（P<001），DA/5-HT下降（P<005）。2）运动后即刻海马组织GDNF、GFRα-1mRNA相对表达率和GDNF、GFRα-1平均蛋白表达水平升高；恢复期12 h高于C组和E0组（P<001）；恢复期24 h降低并低于E1组（P<001）。结论：1）经7周疲劳模型运动后大鼠已经出现中枢疲劳。2）运动性中枢疲劳后大鼠海马组织GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达水平上升，提示GDNF和GFRα-1可能参与了中枢疲劳恢复的神经生物学调控过程。 关键词：中枢疲劳；运动性疲劳；大鼠；海马组织；胶质细胞源性神经营养因子；胶质细胞源性神经营养因子受体 中图分类号：G8047文献标识码：A文章编号：1006-2076（2015）02-0068-06 Abstract：Objective： To investigate the dynamic changing features of the glial cell line-derived neurotrophic factor （GDNF）， GDNF family receptor α-1mRNA （GFRα-1mRNA） and relative protein expression in hippocampus of rats during different phases of recovery period after fatigueMethods：32 male SD rats （2 month old） were randomly divided into control group （C group， n=8） and收稿日期：2015-03-10 基金项目：[山东省自然科学基金（ZR2009CQ032）。 作者简介：[陈万（1962-），男，江苏南京人，博士，教授，研究方向运动与骨骼肌生物学效应。 作者单位：[1山东体育学院，山东 济南250102；2山东省微山县实验中学，山东 微山277600；3山东省体育科学研究中心，山东 济南250102 1 Shandong Sport University， Jinan 250102， Shandong， China； 2 Weishan Experimental Middle School， Weishan 277600， Shandong； 3 Shandong Research Center of Sports Science， Jinan 250102， Shandong， China experimental groups （E group， n=24） At the sampling time， the experimental groups were randomly divided into the group immediately （E0， n=8）， 12 h （E1， n=8）， and 24 h （E2， n=8） after exhaustive running All rats in experimental groups were assigned a 7-week training program increasing load by degrees with a final exhaustive running The 5-HT， DA， and the expressions of GDNF and GFRα-1mRNA from hippocampus of rats were measuredResults：All rats in experimental groups were assigned a 7-week training program increasing load by degrees Immediately after the last exhaustive running： 1） the hippocampus 5-HT was significantly higher（P<005）， and DA， DA/5-HT were significantly lower （P<001） than those of C group 2） The correspondence expression rates of GDNF and GFRα-1mRNA， and the protein expressions of GDNF and GFRα-1 were higher than those of C respectively 12h post-exercise， all indexes of E1 group were higher than those of C and E0， respectively （P<001） 24 h post-exercise， all indexes of E2 group were lower than those of E1（P<001）Conclusion： 1） The rat was instantly reach central fatigue after treadmill movement after 7 weeks 2） While exercise-induced central fatigue occurs， there are up-regulations in the levels of expression of GDNF， GFRα-1mRNA and protein in rat hippocampus， which indicates that both GDNF and GFRα-1mRNA have participated in neurobiological regulation process recovered from exercise fatigue [WTHZ]Key words：[WTBZ]central fatigue；exercise-induced fatigue； rat； hippocampus； glial cell line-derived neurotrophic factor （GDNF）； GDNF family receptor alpha-1 运动性疲劳可能同时发生在外周和中枢部位，中枢疲劳能破坏中枢神经系统的基本稳态，使大脑调控随意肌运动的机能下降，主要表现在运动皮层以及运动神经元的兴奋降低、神经冲动发放不足，从而导致运动单位激活数量不够[1]。研究表明[2-5]，胶质细胞源性神经营养因子 （Glial cell line-derived neurotrophic factor， GDNF） 对多巴胺能神经元有较强营养和修复作用，能挽救损伤的多巴胺能神经元并促进其恢复，有效保护中脑的多巴胺循环，而多巴胺又是影响中枢疲劳的重要因素。GFRα-1是GDNF最主要的受体，GDNF与其受体GFRα结合形成GDNF-GFRα复合体，激活Ret受体，促使细胞内Ret-Shc-Grb2蛋白复合体形成，Ret-Shc-Grb2蛋白复合体激活相关蛋白引起一系列信号传导，发挥其生物学效应[6-8]。 本研究通过对运动性中枢疲劳恢复期大鼠海马组织GDNF、GFRα-1 mRNA及其蛋白表达水平变化的观察，分析GDNF、GFRα-1表达在恢复期不同时相的动态变化特征，探究中枢疲劳产生的神经生物学机制，为消除运动性中枢疲劳提供理论依据。 1研究对象与方法 1.1研究对象及分组 32只健康雄性SD大鼠 （2月龄），（220±10）g，山东中医药大学实验动物中心提供。常规分笼喂养普通鼠全价颗粒饲料Ⅱ号饲料（北京实验动物研究中心提供），自由饮水进食，动物室内温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%。 32只健康雄性SD大鼠随机分为：对照组 （C组，n=8，不进行训练）；实验组 （E组，n=24），疲劳模型运动后随机分为运动后即刻组 （E0组，n=8）、恢复期12 h组 （E1组，n=8）、恢复期24 h（E2组，n=8）。 1.2研究方法 1.21疲劳模型运动方案 本实验中疲劳模型运动方案依据Bedford等[9]研究者的回归方程理论进行设计。国内研究者汶希等[10]报道，采用每周7次，连续2周的运动方案 （15×15、15×15、18×20、18×20、18×25、18×25、20×25；25×25、25×25、25×30、25×30、30×30、30×30、30×30 m/min×min，坡度0°），大鼠下丘脑γ-氨基丁酸 （gamma-aminobutyric acid， GABA）和5-羟色胺 （5-hydroxytryptamine， 5-HT） 含量显著升高，多巴胺 （dopamine， DA） 和乙酰胆碱 （acetylcholine， Ach） 含量显著性下降，表明出现中枢和外周疲劳。为了有效地导出中枢疲劳，本实验参考国内外学者[9-12]的运动疲劳模型，增加了运动强度（跑台速度）和周数 （速度和时间安排见表1）。 1.22动物取材及样本处理 7周疲劳运动后即刻，C组和E0组大鼠腹腔注射10%水合氯醛糖浆（03 mL/100g） 麻醉，断头后立即在冰面上分离脑区海马组织，备测 5-HT、DA、和GDNF、GFRα-1 mRNA及蛋白表达等。E1组和E2组大鼠分别在7周疲劳运动后12 h和24 h取材 （方法同上）。将海马组织称重后放入1 mL组织匀浆器中，加入01 mol/L高氯酸1 mL和005%Na2EDTA混合水溶液1 mL，在冷环境下匀浆，将匀浆液用超速冷冻离心机，4℃条件下10 000 r/min离心10 min，取上清液分装于EP管内以测5-HT、DA。 1.23指标测试 1.24RNA抽提及cDNA的合成 RNA抽提及cDNA的合成过程具体操作方法严格按照RIAZLRNA试剂盒（美国Invitrogen公司，专利号：5346994）、EasyScript cDNA第一链合成试剂盒（北京Tiangen Biotech公司）说明书进行。总反应体系20 uL，置于55℃～60℃中温育 10 min 使其加快溶解，提取的RNA立即用于cDNA的合成。 1.25引物设计 所有引物设计由上海迪奥生物科技有限公司设计及合成，GFRα-1上游引物5-CTATCGTCCCTGTGTGCTCCT-3，下游引物5-CACACTGAGGCTGCTGGAGT-3；GDNF上游引物5-GAACCAAGCCAGTGTATCTCCT-3，下游引物5-ATCGTCTCTGCCTTTGTCCTC-3；β-Actin上游引物5-GCACCACACCTTCTACAATGAG-3，下游引物5-CAGAGGCATACAGGGACAGC-3[13]。 1.26Real-time PCR检测 反应体系在ABI 7000 Fast Real-time PCR System上进行，PCR反应体系（20ul反应体系）包括：SYBR Premix Ex Taq TM缓冲液10 μl，ROX染料04 μl，上下游引物（10uM）各04 ul，cDNA模板20 ul，灭菌蒸馏水68 ul，共20 ul。扩增第一步，95℃ 30 s预变性；第二步，95℃ 5 s、60℃ 30 s，PCR反应40个循环；第三步，95℃ 15 s、60℃ 60 s，95℃ 15 s解离。实时检测每一循环的系统荧光强度，通过对荧光强度的分析完成等量检测的目的[13]。 1.27海马组织免疫组织化学染色 海马组织经4%多聚甲醛溶液固定4 h后进行石蜡切片制备，切片脱蜡和水化后经PBS溶液冲洗，严格按照免疫组织化学染色步骤、DAB显色试剂盒和GDNF、GFRα-1抗体试剂盒要求进行。 1.3统计方法 采用SPSS170软件系统进行统计，所有数据结果以平均数±标准差 （[AKx-]±s）表示。C组、E0组、E1组、E2组四组之间采用单因素方差（One-Way ANOVA）分析，并进行后续检验的多重比较（Post Hoc Multiple Comparisons）。显著性水平为P<005，非常显著性水平为P<001。 2结果 2.1海马组织5-HT、DA、DA/5-HT测试结果[WTBZ] 对大鼠海马组织匀浆上清液进行5-HT、DA指标测试，结果如表3所示，经疲劳模型运动后，E0组、E1组、E2组5-HT都升高（P<001），E1组、E2组高于E0组（P<001），E2组低于E1组（P<005）。E0组、E1组DA都降低（P<001）；E1组低于E0组（P<005），但E2组高于E0组（P<005）；运动后24 h E2组升高（P<005）。E0组、E1组、E2组DA/5-HT降低（P<005）；E1组低于E0组（P<001）；E2组高于E1组（P<001）。[WTBZ] 2.2海马组织GDNF、GFRα-1 mRNA相对表达率测试结果 大鼠海马组织GDNFmRNA、GFRα-1mRNA相对 2.3大鼠海马组织GDNF、GFRα-1平均光密度值测试结果 免疫反应阳性细胞，表现为较为粗大的棕黄或棕褐色颗粒分布于细胞浆，见图2、3。大鼠海马组织的GDNF平均光密度值，E1组高于E0组和C组（P<001），E2组较E1组降低（P<001）。大鼠海马组织的GFRα-1平均光密度值，E1组高于E0组和对照C组（P<001），E2组较E1组降低（P<001），结果如表4所示。 3讨论与分析 3.1大鼠海马组织5-HT、DA、DA/5-HT比值变化 5-HT是一种抑制性单胺类神经递质，脑组织内的5-HT参与多种神经生理功能的调节过程，如情绪变化、体温调节、睡眠等，同时又与力量感知、肌肉疲劳存在较为密切的关系。有研究者报道[14-16]，大强度或力竭运动后大鼠脑组织不同区域的5-HT含量升高，使得神经递质的相对平衡遭到破坏，引起中枢紊乱，从而产生中枢疲劳。 从本实验结果分析（见表3），疲劳模型运动后即刻，大鼠海马组织5-HT含量显著升高 （P<001），与上述研究报道结果相似，说明中枢神经抑制明显加强，出现中枢疲劳；运动后12 h，5-HT含量进一步升高到峰值（P<001），说明本实验采用的运动疲劳模型的运动强度 （跑台速度） 相对较大、时间较长，造成的中枢神经抑制进一步加深，疲劳程度也在运动后12 h达到最大；运动后24 h，5-HT在单胺氧化酶的作用下氧化分解，生成酸性代谢产物—5-羟吲哚乙酸等产物[14]，促使5-HT呈下降趋势。 DA是首次被证明在中枢疲劳中发挥作用的一种神经递质，能激发并促进肌肉协调能力等。以往的研究结果[16-19]显示，力竭运动或长时间大强度运动后，大鼠端脑、中脑、下丘脑等部位的DA含量显著性下降，同时DA/5-HT比值明显降低，认为DA/5-HT比值变化更能准确反映中枢疲劳状况，DA/5-HT比值的明显降低可能是导致中枢疲劳的主要因素之一。 本实验结果分析，第2～7周的长时间中大强度的运动导致大鼠海马组织DA的合成水平明显降低，但随着休息时间增长和多巴胺受体功能性增强，多巴胺递质分泌量逐渐增多，所以24 h后DA呈上升趋势，结合前人研究的结论[16-18， 20]，说明本实验中大鼠经过运动疲劳模型运动后已达到中枢疲劳状态。 3.2大鼠海马组织GDNF、GFRα-1 mRNA及蛋白表达 GDNF与脑源性神经营养因子（BDNF）具有相似的结构和生物学功能，属于神经营养因子家族成员。研究证实，机体在进行长时间大强度训练时，为避免神经元过度损伤，而发生自我保护性应答使海马组织神经元BDNF表达水平相对升高[21-22]。GDNF受体是由细胞膜外的GDNFRα和Ret蛋白组成，Ret蛋白则是各个GDNFRα受体的共同的配基；GDNF受体的存在是神经元对GDNF产生生物学效应的前提。 [JP2]研究表明[3-4， 7， 23]，GDNF生物学效应的机制是由于GDNFRα固定于细胞膜的外层，没有跨膜部分，传导信号受阻，因此GDNF首先与具有高度亲和力的GDNFRα结合发挥协同作用，促进GDNFRα与Ret蛋白的结合，进而激活Ret蛋白的磷酸化，而Ret蛋白磷酸化后可激活下一步细胞内的信息传导通路，从而发挥GDNF的生物学效应。GDNF可以直接作用于DA神经元，对其有明显的营养和促存活作用[8， 23]。国内学者也通过实验证明GDNF能够较强的促进出生后早期大鼠中脑DA能神经元的存活、分化、再生的表达[6]。无论是离体实验还是在体实验都表明GDNF具有营养支持多巴胺神经元的作用，表现为能够显著提高中脑DA水平，促进多巴胺神经元数量明显增加[23]。[JP] 本研究大鼠经过7周疲劳模型运动后，测得运动后即刻、运动后12 h、24 h时大鼠海马组织GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达，结果显示（图1和表4），在以上三个时间点变化呈现先上升，运动后12 h时达到最高，然后下降趋势。该研究中大鼠海马组织GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达出现先升后降，经深入分析讨论得出可能由以下原因造成：第一、大鼠经本实验疲劳模型运动后已经达到中枢疲劳状态，海马组织的DA明显下降，并且运动后恢复期12 h内继续下降。众多研究已经证实无论是在体还是离体，GDNF都具有能够为DA存活提供营养、支持和促进的功能，提升DA的表达水平[6-8， 23-24]。所以当该实验大鼠中枢疲劳后海马组织DA活性降低时，加速了海马组织GDNFmRNA和GFRα-1mRNA相互结合作用，提高了GDNF蛋白表达能力。随着恢复时间的延长，大鼠海马组织的DA活性逐渐升高，GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达相应逐渐降低，到运动后24h时明显降低，且与运动后即刻无明显差异。第二、大鼠在进行该疲劳模型这种长时间大强度训练时，机体为了防止过度疲劳或损伤，而发生的一系列自我保护应答反应。即长时间大强度运动导致中枢疲劳后，海马组织神经元细胞的疲劳甚至损伤，诱导了神经营养因子的高效表达，这种较高的表达能够减轻损伤程度，并有效促进了细胞损伤的修复与再生[6]。运动后伴随恢复时间的延长和运动过程中机体所消耗的营养物质得到有效补充，GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达逐渐恢复到正常水平。第三、GDNF对运动神经元（Motor neuron， MN）的作用。实验证实GDNF对MN具有广泛的、有效的营养作用，能挽救、修复损伤后的MN，还能够维持离体MN的存活并促进其生长。这些功能是在已发现的神经营养因子中仅有的，而GDNF以上功能的发挥可能与其能够有效阻止乙酰胆碱转移酶活性下降有关[3-4，25]。本实验大鼠中枢疲劳过程中，大鼠MN受到不同程度的损伤或是死亡，而损伤的MN修复则需要GDNF提供部分的营养，所以此时GDNF的表达就会提高。 在本实验中，7周疲劳模型运动后恢复期24 h内，大鼠海马组织GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达水平变化特征显示，大鼠海马神经细胞可通过GDNF及GFRα-1信号转导途径来降低神经细胞的损伤程度，有效促进损伤神经细胞的修复和再生，以加速神经功能的恢复，发挥神经保护作用。因而提示，GDNF、GFRα-1参与了促进中枢疲劳恢复的神经生物学调控过程。 4结论 4.1大鼠海马组织5-HT、DA等指标的变化表明，7周疲劳模型运动后大鼠出现中枢和外周疲劳，而且24 h后疲劳仍未完全恢复。 4.2中枢疲劳后恢复期大鼠海马组织GDNF、GFRα-1mRNA及其蛋白表达水平的动态变化特征显示，GDNF及其受体GFRa-1参与了促进中枢疲劳恢复的神经生物学调控过程。 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