| 标题 | 三聚氰胺分子印迹表面等离子体共振传感器的制备及分析应用 |
| 范文 | 张丽丽+李洁+陈长宝+朱树华+周杰+尚鹏鹏 ?? 摘要以合成的烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮为功能单体，三聚氰胺为模板分子，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在表面等离子体共振（SPR）传感芯片上合成了分子印迹聚合物薄膜。根据印迹聚合物的朗格缪尔方程式，计算得到三聚氰胺和分子印迹聚合物之间的结合常数为140×108 L/mol。此传感器显示出对模板分子三聚氰胺的高选择性，在pH=75的条件下，此传感器对三聚氰胺的响应最佳，线性范围为01 Symbolm@@ 100 nmol/L（R=09991）。将此传感器用于牛奶和奶粉中三聚氰胺的检测，检出限分别为626 pmol/L和564 pmol/L（S/N=3），回收率分别为915%和920%。 关键词三聚氰胺；分子印迹；表面等离子体共振传感器 1引 言 三聚氰胺（Melamine，MM）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化合物，可用于生产三聚氰胺甲醛树脂，被广泛应用于塑料、涂料、木材加工、造纸、皮革以及电气等行业。MM分子中含氮量达到667%，因而会被不法商家用于食品和饲料中，以提高产品中的氮含量。美国食物及药物管理局标准规定，MM每日最大摄入量为063 mg/（kg·bw）[1]。国家卫生部2011年第10号公告“关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告（2011年 第10号）”中规定，婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg，其它食品中三聚氰胺的限量值为25 mg/kg[2]。长期摄入MM会导致肾结石，甚至诱发膀胱癌或肾衰竭[3，4]。因此，食品中MM的检测引起了极大的关注。目前检测MM的方法有高效液相色谱法、高效液相色谱质谱联用法和气相色谱质谱法[5， 6]、比色法[7，8]、酶联免疫法[9，10]、表面增强拉曼法[11，12]等。但因为食品基质复杂，且MM在食品中含量低，所以大多数方法的前处理过程比较繁琐，常需进行样品富集，耗时费力。因此，发展前处理简便、选择性好、灵敏度高的检测方法很有必要。 近年来，表面等离子体共振技术（SPR）由于具有简易、快速、无标记及灵敏度高等特性而备受关注，SPR传感器在生命科学领域已得到广泛应用[13～16]。然而SPR传感器常需要采用昂贵且不稳定的配体分子如抗原或受体， 识别目标分子，这一不足可通过设计一些耗费低且具有稳定的识别位点的探针等方法克服[17]。分子印迹技术能提供特异性结合位点[18]，而且印迹聚合物具有很高的化学稳定性，成本低，制备简单，可循环利用[19]。因此，结合SPR和分子印迹技术的优点，可有效提高目标物的检测灵敏度和选择性。本课题组在前期工作中制备了系列SPR印迹传感器，并成功用于复杂样品中目标物的检测[17，20～23]。其中，以4乙烯基吡啶为功能单体制备了双酚A传感器，建立了双酚A的检测方法[17]；以甲基丙烯酸为功能单体制备了3，3二氯联苯胺传感器，将其用于自来水和土壤样品中3，3二氯联苯胺的检测[22]。 根据三聚氰胺分子特点，本研究设计合成了一种能与MM通过氢键有效结合的功能单体烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮。利用分子印迹技术，在SPR传感芯片上修饰三聚氰胺分子印迹聚合物，建立了检测MM的SPR分析方法，对于环境和食品样品中MM的检测和分离具有重要意义。 2实验部分 21仪器与试剂 FTSPR 100型表面等离子体共振仪、传感金片（18 cm×18 cm）（美国Thermo公司）； Mercury Plus400型核磁共振仪（美国Varian公司）。 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、苯代三聚氰胺、碳酸二乙酯（分析纯，Aldrich公司）； 偶氮二异丁腈（AIBN，分析純，天津北联精细化工有限公司）； 烯丙硫醇（70%，上海市晶纯试剂有限公司）； MM（化学纯，上海试剂一厂）； 三聚氰酸（化学纯）、缩二脲（分析纯）（Aladdin公司）； 二甲亚砜（DMSO，分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司）； 丙烯胺（分析纯，成都贝斯特试剂有限公司）； 乙腈（色谱纯，天津市永大化学试剂有限公司）。实验用水为二次蒸馏水。所有溶液在进行SPR实验前，均通过045 μm醋酸纤维素膜过滤。 22实验方法 221功能单体的合成与表征（1）硝基缩二脲的合成[24]： 将375 mL浓H2SO4和90 mL浓HNO3置于烧杯中，冷却至0℃。加入150 g缩二脲，冰浴搅拌1 h后，室温搅拌至固体全部溶解。加入300 g冰，搅拌至室温后抽滤。将所得固体溶于水中，用1 mol/L NaOH调节至pH 85，过滤，用37% HCl调节至pH 20，抽滤，真空干燥。得到白色固体产物80 g，产率37%。熔点： 231℃；1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ： 7180 （br d， 2H）， 9334 （br s， 1H）； 13C NMR （400 MHz， CDCl3） δ： 147765 （CO）， 15301（CO）；IR （KBr） v： 3426， 3290， 2974， 2807， 1736， 1631， 1576， 1489， 1431， 1386， 1335， 1201， 1073， 1015， 957， 758， 598， 503 cm Symbolm@@ 1。 （2）烯丙基缩二脲的合成[25]： 将80 g硝基缩二脲和480 mL水放入100 mL的圆底烧瓶中，逐滴加入40 mL丙烯胺，搅拌1 h后加热回流2 h，冷却至室温。旋转蒸发后所得固体用水重结晶，抽滤，真空干燥。得到白色固体产物177 g，产率23%。熔点： 141～142℃；1H NMR（400 MHz， DMSO） δ： 3778（t， 2H， NCH2）， 506～518（m， 2H， CH2） 579～589（m， 1H， CH）， 6608（s， 2H， NH2）， 7622（s， 1H， NH）， 8618（s， 1H， NH）；13C NMR（400 MHz， DMSO） δ： 41065（CH2N）， 114760（CH2）， 134684（CH）， 154323 （CO）， 155649 （CO）。 （3）烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮 （Allylcyanurate）的合成[25]： 将0856 g Na加到413 mL无水乙醇中制得乙醇钠，再加入177 g烯丙基缩二脲和2921 g碳酸二乙酯， 加热回流4 h。冷却至室温， 抽滤，用乙醇乙醚（1∶1， V/V）溶液洗涤固体，用浓HCl重结晶，5℃下放置12 h，抽滤，真空干燥。得到白色产物154 g，产率74%。熔点： 211～213℃；1H NMR （400 MHz， DMSO） δ： 4289 （t， 2H， NCH2）， 5115～5199 （m， 2H， CH2）， 5764～5860 （m， 1H， CH）， 11452 （s， 2H， NH）；13C NMR （400 MHz， DMSO） δ： 42123 （CH2N）， 116564 （CH2）， 131773 （CH）， 148221 （CO）， 149167 （CO）；IR （KBr） v： 3442， 3227， 3100， 2955， 1770， 1590， 1460，1398， 943， 760 cm Symbolm@@ 1。 222三聚氰胺分子印迹SPR传感器的制备三聚氰胺分子印迹SPR传感器的制备过程见图1。将SPR裸金传感片放入新配制的Piranha溶液（H2SO4H2O2， 70∶30， V/V）中清洗2 min，用水冲洗芯片，氮气吹干后放入含有10 mmol/L烯丙硫醇的乙醇溶液中，4℃放置过夜。用乙醇、水反复冲洗，氮气吹干。称取2090 mg功能单体和120 mg MM，溶于7 mL DMSO中，静置2 h使二者形成稳定的复合物。然后加入590 mg AIBN和1577 mg EGDMA，将上述传感金片放入其中，密封，通氮气除氧15 min，60℃引发聚合，反应24 h。取出金片，用甲醇和水清洗芯片表面，再将其放入2%乙酸和18%甲醇溶液中，除去模板分子和未反应的化合物。用无水乙醇和水清洗金片，氮气吹干。非印迹聚合物芯片制备方法除不加MM外，其它步骤与上述方法相同。 223实际样品的制备奶粉样品提取： 取50000 g奶粉，加入15 mL甲醇，室温下超声提取15 min。10000 r/min离心3 min，上清液减压蒸干，溶于50 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH=75）中。 液态牛奶样品提取： 取500 mL纯牛奶置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，振荡1 min后以10000 r/min离心3 min，上清液减壓蒸干，溶于50 mL PBS（pH=75）中。 Symbolm@@ 1左右，此时入射角有最小的反射率。控制实验温度为25℃，流动缓冲溶液为PBS （02 mol/L Na2HPO4NaH2PO4，pH=75）。考虑识别位点与三聚氰胺的氢键结合作用，选择2%乙酸和18%甲醇溶液为再生液。每次测试前，SPR传感金片用再生液以流速286 mL/min冲洗，波数迅速下降，稳定后用PBS冲洗直至得到稳定的SPR基线。将不同浓度的被检测物溶解于流动缓冲液中，以流速0225 mL/min进入到流动池中，直到波数变化达到稳定值，通过FTSPR实时记录波数变化（图2）。 3结果与讨论 31三聚氰胺分子印迹膜厚度的计算 传感片的镀金薄膜首先通过AuS 键连接上双功能分子烯丙硫醇，再通过烯丙硫醇的双键与功能分子中烯丙基端的作用连接上分子印迹聚合物涂层。图3是裸金片和修饰上印迹聚合物（MIP）及非印迹聚合物（NIP）后的金片在磷酸盐缓冲液中的SPR谱图。与裸金片相比，MIP和NIP金片的波数分别红移了31347和18336 cm Symbolm@@ 1，表明在传感器表面形成了一定厚度的印迹和非印迹聚合物。根据文献[26]计算厚度的方法，MIP和NIP金片的膜厚度分别约为78和46 nm。 32pH值对吸附性能的影响 印迹聚合物对MM的识别作用主要靠识别位点上的羰基和亚氨基与MM分子中的氨基和杂环氮之间的互补氢键作用，pH值可能影响印迹聚合物对MM的识别灵敏度。考虑到两者之间的氢键作用及三聚氰胺是弱碱性化合物，测定了pH 65～85范围内三聚氰胺分子印迹传感器对90 nmol/L MM的响应。如图4所示，pH=75时，波数位移最大，说明此pH值下与印迹聚合物中识别位点的氢键作用最强。因此，本实验中选择pH=75。 33三聚氰胺分子印迹聚合物的吸附性 为评价三聚氰胺分子印迹聚合物对目标分子的吸附能力，在最佳pH值条件下测定了MIP和NIP传感芯片的性能。由图5可见，MM浓度在01 nmol/L～30 μmol/L范围内，波数位移随浓度的增大而升高，当浓度大于30 μmol/L后，波数位移不再变化，说明此时吸附达到饱和。MIP传感芯片达到饱和时的波数位移为13 cm Symbolm@@ 1，而NIP芯片达到饱和时的波数位移为26 cm Symbolm@@ 1。说明由于印迹效应，MIP芯片对三聚氰胺的吸附效果更好。如图5插图所示，MM浓度在01～100 nmol/L时，MIP芯片对MM的波数响应与其浓度呈良好的线性关系，方程为v（cm Symbolm@@ 1）=08083+0 4460CMM （nmol/L） （R=09991），检出限为426 pmol/L（S/N=3）。 其中，v和vsat分别表示波数变化和吸附MM达到饱和后的波数变化，Kass为MM和分子印迹聚合物之间的结合常数。根据图5结果，得到印迹聚合物的朗格缪尔方程式为： 1v=01119+7988×10 Symbolm@@ 10[MM]（R=09979）。 由直线方程截距和斜率的比值得到Kass=140×108 L/mol。由ΔG= Symbolm@@ RTlnKass可得到印跡聚合物和MM之间结合的热力学参数ΔG= Symbolm@@ 465 kJ/mol， ΔG<0说明印迹聚合物中的结合位点和MM之间的结合是自发过程。 传感器经2%乙酸和18%甲醇溶液再生后可重复使用。传感器对90 nmol/L MM重复测定11次的相对标准偏差为21%。表明传感器具有较好的稳定性，且再生效果较好。 34三聚氰胺分子印迹聚合物的选择性 考察了浓度均为40 nmol/L的MM及其三种结构类似物三聚氰酸（Cyanuric acid）、苯代三聚氰胺（Benzoguanmine）和鸟苷（Guanosine）在分子印迹SPR传感芯片上的相应。由图6可知，与NIP芯片相比，MIP芯片显示出对模板分子的高选择性，表明印迹过程中在聚合物的内部形成了对模板分子识别的特异性结合位点，位点的结构大小和功能基位置都与目标分子相匹配，而与其它3种化合物不匹配。 35实际样品分析 为了检验建立的三聚氰胺分子印迹SPR测定方法分析实际样品的可行性，向牛奶和奶粉样品提取液中加入MM标准液，使得MM终浓度为20 nmol/L，进行SPR分析。由表1可见，牛奶和奶粉中MM的平均回收率为915%和920%。当信噪比为3时，牛奶和奶粉的检出限分别为626 pmol/L（79 ng/kg）和564 pmol/L（71 ng/kg），低于国标GB/T 223882008中的最低定量限0005 mg/kg[5]和GB/T 224002008中检出限005 mg/kg[6]，以及卫生部公告[2]的限量值。 4结 论 以合成的烯丙基1，3，5三嗪2，4，6（1H，3H，5H）三酮作为功能单体，MM为模板分子，制备了三聚氰胺分子印迹SPR传感器，用于牛奶和奶粉样品中MM的检测，检出限分别为626 pmol/L和564 pmol/L。 与国标方法相比，本方法具有较高的选择性和灵敏度，可用于复杂样品中MM的分析。 References 1US Food and Drug Administration Interim safety and risk assessment of melamine and its analogues in foods for humans， https：//wwwfdagov/OHRMS/DOCKETS/98fr/FDa2008n0574bkgpdf， 2008 2Announcement No 10， Announcement on the limit value of melamine in food Ministry of Health of the People's Republic of China， 2011 关于三聚氰胺在食品中的限量值的公告 卫生部公告2011年第10号， 中华人民共和国卫生部， 2011 3Dorne J L， Doerge D R， Vandenbroeck M， FinkGremmelsc J， Mennesd W， Knutsene H K， Vernazzaf F， Castleg L， Edlerh L， Benford D Toxicol Appl Pharmacol， 2013， 270（3）： 218-229 4Hsieh T J， Hsieh P C， Tsai Y H， Wu C F， Liu C C， Lin M Y， Wu M T Toxicol Sci， 2012， 130（1）：17-32 5GB/T 223882008 Determination of Melamine in Raw Milk and Dairy Products National Standards of the People's Republic of China 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 中华人民共和国国家标准 GB/T 223882008 6GB/T 224002008 Rapid Determination of Melamine in Raw Milk high Performance Liquid Chromatography Method National Standards of the People's Republic of China 原料乳中三聚氰胺快速检测 液相色谱法 中华人民共和国国家标准 GB/T 224002008 7Wei F， Lam R， Cheng S， Lu S App Phys Lett， 2010， 96（13）： 1337021337023 8Wu Z， Zhao H， Xue Y， Cao Q， Yang J， He Y， Li X， Yuan Z Biosens Bioelectron， 2011， 26（5）： 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equation for imprinted polymer， the association constant （Kass） of imprinted sites in the imprinted film to melamine was calculated to be 140×108 L/mol The SPR sensor showed high selectivity to the template molecule melamine， and the best response was obtained at pH=75 The method showed good linearity in the melamine concentration range of 01-100 nmol/L （R=09991） Based on a signal to noise ratio of 3， the detection limits of melamine were 626 pmol/L and 564 pmol/L for the milk and milk powder， respectively The recoveries were 915% for milk and 920% for milk powder These results suggest that SPR sensing combined with MIP film is a promising alternative method for detection of melamine KeywordsMelamine； Molecular imprinting； Surface plasmon resonance sensor |
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