| 标题 | 基于三唑磷残留限量值的多检测线免疫试纸条的制备与应用 |
| 范文 | 龚航 刘贝贝 李盼 何丹 郭逸蓉 王利民 华修德 王鸣华 刘凤权 徐振林 张存政 王丽 摘 要 建立了基于三唑磷残留限量值（MRL）的免疫层析检测方法，可裸眼观察判断谷物、蔬菜和水果中的三唑磷农药残留水平。以粒径20 nm的胶体金标记三唑磷单克隆抗体于金标垫上，包被不同浓度的三唑磷包被原（检测线T1、T2、T3线）、羊抗小鼠IgG抗体（质控线C线）于硝酸纤维素（NC膜）上，与吸水垫及PVC底板组合成层析试纸条。以大米、甘蓝和苹果为对象，优化了样品前处理方法、提取试剂等条件。结果表明，基于1/10 三唑磷MRL值的试纸条（I）对三唑磷的裸眼观察检测灵敏度可达0.005、 0.01和0.02 μg/mL，优化调整后获得试纸条Ⅱ灵敏度设定为国标GB2763中的三唑磷MRL值依次为0.05、 0.1和0.2 μg/mL，并与3条检测线一一对应。 结合前处理方法优化结果，样品经乙腈提取后， 用PBS稀释10倍或者等体积溶剂置换后检测，此两种试纸条在8～12 min内均可准确判定农产品中三唑磷的残留是否超过MRL值，同时多区间定量范围的设定亦可较为准确地定量其残留值，结果与GC方法一致。本研究采用基于MRL值的3条检测线，对检测结果的判定更为直接、准确，无需换算，为基于MRL农产品安全性的快速判断提供了更为直观、简单、准确的方法。 关键词 三唑磷； 免疫层析试纸条； 残留限量值； 快速检测 1 引 言 三唑磷（Triazophos O，O-二乙基-O-（1-苯基1，2，4三唑-3-基）硫代磷酸酯）是一种广谱性杀虫剂[1]，对鱼类、蜜蜂、家蚕具有高毒性[2]，对哺乳动物有中等毒性，可抑制乙酰胆碱酯酶活性，从而影响中枢神经功能[3，4]。三唑磷作为高效替代农药已在全国推广应用多年，在甲胺磷、对硫磷等高毒有机磷杀虫剂被限制或禁止使用之后，三唑磷以其低毒、高效和广谱的特点在水稻等作物上的使用量迅速增加。但三唑磷的半衰期较长，在环境中易残留，可通过迁移、扩散和转化进入食物链，对环境、生物以及人类健康产生危害[5]。各国均对三唑磷的残留进行了限定[6，7]。国标GB 2763-2016对谷物、油料和蔬菜、水果中三唑磷的最大残留限量分别为0.05、0.1和0.2 mg/kg[8]；农业部公告第2032号规定，从2016年12月31日起，禁止在蔬菜上使用三唑磷。因此，建立三唑磷残留快速检测技术，对于保障食品安全和人类健康、减少环境污染具有重要意义。 三唑磷残留的常规检测方法主要包括色谱法、酶联免疫吸附法（ELISA）和其它生物分析方法。色谱法主要包括气相色谱法（GC）[9～13]，高效液相色谱法（HPLC）[14，15]和高效液相色谱法串联质谱法（HPLC-MS）[16～18]。仪器分析方法准确性高、专一性强，但样品前处理过程复杂，耗时長，需要昂贵的仪器和专业技术人员，不利于对大批量样品的现场快速检测和监测。快速检测方法包括表面增强拉曼光谱法[19，20]、酶联免疫试剂盒[5，21，22]、压电免疫传感器[23]和胶体金免疫层析试纸条等。其中胶体金免疫层析试纸条操作方便，检测时间短，不需要复杂仪器判定，定性准确，裸眼即可观察结果，是目前应用最广的快速检测方法。Gui等[24]用胶体金免疫层析试纸条检测加标土壤和水中的三唑磷农药残留，LOD达到5 ng/mL。Guo等[25]建立了两种同时检测克百威和三唑磷的胶体金免疫层析试纸条，对三唑磷的最低检测浓度分别达到了8和4 μg/L。文献[26，27]分别建立了一种多条检测线、裸眼半定量检测黄曲霉毒素的胶体金免疫层析试纸条，使检测结果能提供更多参考信息。但基于三唑磷MRL值的农产品安全性检测、裸眼数字化的胶体金免疫层析试纸条的研究未见报道，本研究通过设定检测线阈值，建立了基于三唑磷残留限量值（MRL）的免疫层析检测方，裸眼观察即可确定三唑磷农药残留量范围，并与仪器方法进行了比对，以大米、甘蓝和苹果为模型样本进行了方法验证。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 XYZ3050TM胶体金喷膜机（Bio-Dot公司）；ZQ2000微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）；Lambda25UV/VIS spectrometer 双光束紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司）；Multiscan ascent 酶标仪（美国Thermo公司）；6890N气相色谱仪（美国Agilent公司）；硝酸纤维素膜（NC膜）、金标结合垫、吸水垫（美国Millipore公司）；聚氯乙烯（PVC）底板、样品垫（上海金标科技生物有限公司）；恒温振荡培养箱（太仓华利达实验设备有限公司）；超纯水净化仪（Labconco公司）。 2.2 胶体金制备与标记 2.2.1 胶体金制备 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[29]：在200 mL超纯水中加入2% HAuCl4溶液1 mL，加热至沸；快速加入1%柠檬酸三钠溶液4.8 mL，继续加热4 min；得到的酒红色液体即为制备的胶体金溶液。室温避光冷却后，用超纯水定容至200 mL，4℃避光保存。 2.2.2 pH值优化 向10个已加入1 mL胶体金的离心管中依次分别加入0、1、2、3、4、5、6、7、8和9 μL的K2CO3（0.1 mol/L）溶液调节pH值，混匀后，分别加入20 μL三唑磷单克隆抗体溶液（1 mg/mL），混匀后静置2 h观察，将未出现沉淀的溶液取上清液，在400 ～ 600 nm处进行吸光度测定，吸光度最大的胶体金溶液所对应的K2CO3用量，即为最佳pH值标记条件。 2.3 胶体金免疫探针的制备 2.3.1 抗体最佳标记量的确定 取11个2 mL离心管，分别加入调至最佳pH值的胶体金溶液，再依次加入0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 μL三唑磷单克隆抗体溶液（1 mg/mL），室温静置5 min，分别加入10% （m/V）NaCl溶液100 μL，5 min后观察各管溶液颜色变化，判断抗体最适标记量。 2.3.2 胶体金标记抗体 取5 mL调至最佳pH值的胶体金溶液，搅拌下缓慢加入最适量的抗体（1 mg/mL），搅拌30 min；加入10% BSA溶液，使BSA终浓度为1%，继续搅拌30 min后，1500 r/min离心15 min，弃去沉淀；上清液以12000 r/min离心35 min后，弃上清液，加入洗涤保存液（0.01%硼酸，0.2% PEG20000，0.02% NaN3）重悬沉淀至原体积；再以12000 r/min 离心35 min后，弃去上清液，加入5 mL洗涤保存液重悬沉淀，即得金标三唑磷单克隆抗体复合物，于4℃避光保存。 2.4 免疫试纸条的准备 2.4.1 试纸条的组装 将NC膜贴在PVC底板的中间，在NC膜的一端依次贴上金标抗体结合垫和样品垫。将吸水垫贴在NC膜的另一端，样品垫、金标抗体结合垫、NC膜、吸水垫依次交叠1 mm。将3种不同浓度的三唑磷包被原与羊抗小鼠IgG分别喷涂在NC膜上作为检测线（T1、T2、T3线）和质控线（C线），在金标结合垫上喷涂上金标三唑磷单克隆抗体，37℃干燥2 h。组装的试纸条结构如图1所示。 2.4.2 基于MRL值的试纸条检测及结果判定 采用ELISA常用的棋盘滴定法优化3条检测线喷涂三唑磷包被原的量，以及固定金标抗体的量，以不同的三唑磷MRL值为检测限，当相对应检测线颜色消失时，可以确定检测三唑磷浓度范围，并可直观确定残留量是否超标。结果判定示意图如图2所示。 （1）当待检样品不含或者所含三唑磷浓度小于0.05 μg/mL时，溶液因毛细作用向上迁移，溶解金标垫上胶体金标记的三唑磷单克隆抗体，并与之形成复合物，多余的三唑磷单克隆抗体继续向上迁移，到达检测线时，与检测线上的三唑磷包被原结合形成沉积，使T1线显色；过量的金标三唑磷抗体及与三唑磷结合形成的复合物继续向上迁移，依次与T2线和T3线包被的三唑磷包被原结合；同时过量的金标三唑磷抗体及其与三唑磷结合形成的复合物继续向上迁移，与质控线（C线）上的羊抗鼠二抗结合，形成肉眼可见的红色。此时3条检测线与质控线均显色，结果判断为阴性 （图2A）。 （2）当待检样品中三唑磷浓度在0.05～0.10 μg/mL范围时， 其作用原理同（1），但由于样品液中的三唑磷消耗掉了一部分金标抗体形成复合物，而金标三唑磷抗体优先与T1、T2线包被的三唑磷包被原结合，形成肉眼可见的红色条带，使得到达T3线时金标三唑磷抗体浓度不足以与T3包被的三唑磷包被原反应，此时T3线完全消失 （图2B） 。 （3）当待检样品中三唑磷浓度在0.10～0.20 μg/mL范围时， 其作用原理同（1）和（2），样品液中的三唑磷消耗了一部分金标抗体形成复合物，而剩余的金标抗体优先与T1线的包被原结合，形成肉眼可见的红色条带，使得到达T2线与T3线时金标抗体浓度不足以与T2线与T3线的包被原反應，此时T2线与T3线完全消失 （图2C） 。 （4）当待检样品含三唑磷浓度高于0.20 μg/mL时，样品液中的三唑磷将金标垫中的金标三唑磷抗体完全消耗殆尽，形成复合物，此时T1、T2、T3线均完全消失，仅C线仍然呈肉眼可见红色 （图2D）。 （5）当C线没有颜色时，无论 T 线是否有颜色，均视为无效结果。 2.5 试纸条最低检出限 用10% 甲醇-PBS溶液分别配制不同终浓度的三唑磷标样，分别取100 μL用金标试纸条检测，将T3检测线消失作为试纸条最低检出限的判定标准，确定试纸条最低检出限。 2.6 试纸条的交叉反应 取杀螟松、对硫磷和甲基对硫磷标样，用10%甲醇-PBS溶液分别稀释到最终浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.10和0.20 μg/mL，分别用试纸条检测，考察试纸条的交叉反应。 2.7 样品提取液的选择与前处理方法优化 为简化样品的提取过程同时保证提取效率，分别进行了缓冲液直接提取、不同有机溶剂提取后缓冲液稀释、溶剂替换等过程，以GC方法[9，30]确证提取效率，比较优化提取试剂及方法。称取10.0 g粉碎的大米、甘蓝、苹果样品至50 mL离心管中，制备浓度分别为0、0.05、0.10和0.20 mg/kg（每个浓度3次重复）的添加样品。分别以10 mL甲醇、乙腈、丙酮、10%甲醇-PBS溶液振荡提取1 min，除加10%甲醇-PBS溶液的样品外，其余样品分别加入1 g NaCl振荡1 min，静置30 min，然后以4000 r/min离心10 min， 吸取上层有机相溶液各1 mL，加入PBS溶液稀释10倍，用于试纸条检测；同时吸取上层有机相溶液各1 mL，氮气吹干，分别以10%甲醇-PBS、丙酮溶液定容至1 mL，过滤后，分别用于试纸条、GC测定。10%甲醇-PBS直接提取的溶液则直接用于试纸条的检测。 3 结果与分析 3.1 胶体金粒径和吸收光谱图 从图3A可见，制备的胶体金溶液的最大吸收波长为516 nm；透射电镜图（图3B）显示，胶体金颗粒粒径均一，粒径约为20 nm。 3.2 金标抗体制备条件优化 3.2.1 最佳pH值的优化 将三唑磷单克隆抗体溶液加入到不同pH值的胶体金溶液中，测定其吸光值，当溶液pH=8.0时，在520 nm处的吸光度最大，溶液状态稳定，为抗体与胶体金结合的最适pH值。 3.2.2 抗体最适标记浓度 上述溶液中加入10% NaCl后，抗体标记的胶体金溶液保持红色不变，则该标记量为最小抗体标记量[31]。结果表明，加入抗体量为0～3 μg/mL时，离心管内颜色呈灰褐色，当加入抗体量为4～6 μg/mL时，离心管内颜色呈紫红色，当加入抗体量为7 μg/mL时，离心管内颜色呈红色，此后随着抗体量加大，管内颜色未有明显变化。因此，三唑磷单克隆抗体的最小标记浓度为7 μg/mL。 选择7.0、7.5、8.0、8.5 和9.0 μg/mL标记浓度对胶体金进行标记，将T线上出现肉眼可见的明显红色的标记浓度确认为抗体的最佳标记浓度。当抗体标记浓度≤7.5 μg/mL时，T线颜色较浅；抗体标记浓度为8 μg/mL 时，T线颜色出现明显的红色条带。因此，选取8 μg/mL作为抗体最佳标记量。 3.3 免疫试纸条的优化 将每两条检测线间的距离区间设置为1～5 mm，以浓度为0、0.05、0.1和0.2 μg/mL三唑磷样品进行测试，结果表明：所有间距变化T1线均能较好显色，当间距设置为3 mm时，3条检测线均可出现，但T2线颜色稍浅。当间距设置大于3 mm时，T2线颜色增强，但T3线颜色变弱甚至消失。当间距设置为2 mm时，3条线之间的颜色梯度肉眼观察并不明显。因此将T1与T2线间距设置为2 mm，T2与T3线间距设置为3 mm，3条检测线均较好显现，且颜色梯度明显，以期达到较好的检测灵敏度。 为了获得多个检测范围，3条检测线的颜色强度将随样品中三唑磷浓度梯度的变化而变弱，随着浓度的增加，T3线首先将会被完全抑制消失，之后是T2线，最后是T1线。通过调整每条检测线的包被原浓度与金标抗体的用量，使条带呈现梯度色差。 参照ELISA的“棋盘滴定法”优化包被原浓度，并满足以下条件：金标结合垫中的金标抗体完全释放后，在8～15 min内可完成迁移过程，迁移通过NC膜（包括背景色），3条检测线呈现梯度色差，达到最佳的检测灵敏度和最小抗体消耗量。 3.4 两种试纸条的制备与比较 配合样品前处理方法，制备了两种类型的试纸条，均可基于三唑磷MRL值进行直接判定是否超标及浓度范围，试纸条Ⅰ的检测限为MRL/10 值的试纸条，可配合样品稀释进行MRL值检测判定； 试纸条Ⅱ是以MRL值为检测限的试纸条，为可配合样品溶剂置换或者无需处理样品的检测，直接判定基于MRL值是否超标及浓度范围，两种试纸条均是针对三唑磷MRL值进行检测。 3.4.1 以1/10三唑磷MRL值为检测限的试纸条（试纸条Ⅰ） 参照上述原理，调整试纸条Ⅰ检测线包被原量和胶体金喷涂量，用梯度稀释的三唑磷样品浓度进行检测，获得检测灵度最佳的试纸条Ⅰ。优化参数如表 1所示。 如图4所示，试纸条在三唑磷样品浓度为0.001 μg/mL（图4F）时T3线颜色明显变弱，在浓度为0.005 μg/mL（图4D）时T3检测线则完全消失，在浓度为0.01 μg/mL（图4C）时T2检测线完全消失，在浓度为0.02 μg/mL（图4B）时，3条检测线完全消失。 基于上述检测结果的判断，试纸条Ⅰ对三唑磷的检测阈值浓度为0.005、0.01和0.02 μg/mL。因此可检测的浓度区间为<0.005 μg/mL、0.005～0.01 μg/mL、0.01～0.02 μg/mL和>0.02 μg/mL。 3.4.2 以三唑磷MRL值为检测限的试纸条（试纸条Ⅱ） 将试纸条Ⅰ优化调整后获得试纸条Ⅱ，检测灵敏度设定为GB2763中三唑磷MRL值，依次为0.05、0.1、0.2 μg/mL，并与3条检测线一一对应，参数如表2所示。 在基于MRL值的基础上，该试纸条相较于传统的试纸条可以较为准确地判断农产品食品的安全性，并可确定浓度范围，如图5所示，当样品浓度在0.05、0.1和0.2 μg/mL时，相对应的T3、T2、T1检测线分别完全消失，而小于这3个浓度时，相对应的检测线不会消失。 3.5 试纸条的交叉反应 试纸条Ⅰ与试纸条Ⅱ分别与杀螟松、对硫磷和甲基对硫磷进行交叉反应实验，均无交叉反应，如图6所示。 3.6 不同提取溶剂对三唑磷提取效率的比较 基于抗体及NC 膜对有机试剂的耐受程度及简化前处理方法、基质干扰（或可出现假阳性、假阴性）的考虑，分别对有机溶剂提取液进行了溶剂替换、PBS 稀释10倍后直接用于试纸条的检测，并进行了GC方法检测确证。结果表明，4种试剂的提取回收率由高到低依次为乙腈>丙酮>甲醇>10%甲醇-PBS，乙腈提取回收率为86.5%～98.0%， 试纸条检测结果与GC检测结果基本一致。因此选取乙腈为提取试剂，PBS稀释10倍后以试纸条Ⅰ（灵敏度为0.005、0.01和0.02 μg/g）进行检测，或者溶剂替换后以试纸条Ⅱ（基于MRL值）进行检测，均可准确判断基于MRL值的农产品安全性，并可根据检测线消失情况确定其浓度范围。两种试纸条均表现出较好的有机溶剂耐受性与抗基质干扰能力。 同时发现NaCl的使用对回收效果影响较大。按2.7节的方法进行样品加标，提取过程中不使用NaCl，则GC检测发现其回收率仅为33.2%～74.7%，试纸条检测结果亦表明回收率较低。添加10% （m/V） NaCl后，样品回收率可稳定为86.5%～980%。 3.7 方法验证与基质干扰影响 样品前处理方法如前所述，乙腈提取液分别进行了PBS缓冲液10倍稀释和溶剂替换后，分别用于试纸条Ⅰ和Ⅱ的检测，检测结果如图7所示，大米、甘蓝和苹果的基质对试纸条检测灵敏度均无影响，基于检测灵敏度为0.005 mg/kg的试纸条Ⅰ，添加浓度≥0.05 mg/kg，用PBS溶液稀释10倍后，检测结果仍为阳性，表明试纸条对样品基质有较好的抗干扰能力。在溶剂替换后，试纸条Ⅱ同样表现出较好的抗基质干扰能力，基质的干扰可以忽略。 4 結 论 配合不同的样品前处理方法，本研究制备了两种基于三唑磷MRL值的胶体金免疫层析试纸条，通过多个检测区间的设定，可以较为准确确定残留浓度范围。与目前已报道的三唑磷胶体金免疫层析试纸条检测方法相比，本方法对三唑磷的检测灵敏度为0.005 μg/mL，基于残留限量值（MRL）的3条检测线的设定，使结果判断更为简单直接，与常见的杀螟松，对硫磷和甲基对硫磷农药均无交叉反应，特异性良好。这两种试纸条的检测阈值设定为国家残留限量值0.05、0.1和0.2 μg/mg，分别与3条检测线一一对应，方法验证参照国家标准GB2763，以大米、甘蓝和苹果作为代表性样品，结合特定的样品前处理方法（10倍稀释与溶剂替换），两种试纸条均能以三唑磷MRL值为检测限量， 并表现出较好的抗基质干扰能力，其检测结果与仪器方法（GC）一致，适用于现场检测大批量样品。农产品种类多样，本研究中未进行油脂类样品的研究，其前处理提取方法更为复杂，需要不同的过程，后续仍需进行更多农产品种类验证，样品提取与前处理方法的验证与优化，扩大试纸条的适用范围。 References 1 ZHANG Zhi-Heng， YUAN Yu-Wei， ZHENG Wei-Ran， SUN Cai-Xia， YANG Gui-Ling， WANG Qiang. Chinese Journal of Pesticide Science， 2011， 13（5）： 485-495 张志恒， 袁玉伟， 郑蔚然， 孙彩霞， 杨桂玲， 王 强. 农药学学报， 2011， 13（5）： 485-495 2 WANG Zhen-Rong， LI Bu-Qing. Pesticide commodities. Beijing： China Business Press， 1998： 72-73 王振荣， 李布清. 农药商品大全（第二版）. 北京：中国商业出版社， 1998： 72-73 3 Singh M， Rishi S.Toxicology Letters， 2003， 144（Supplement.1）： 131 4 Singh M， Rishi S.Environ. Toxicol. Pharmacol.， 2005， 19（3）： 471-476 5 LIANG Chi-Zhou， GUI Wen-Jun， ZHU Guo-Nian. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology， 2008， 8（6）： 102-108 梁赤周， 桂文君， 朱国念. 中国食品学报， 2008， 8（6）： 102-108 6 GE Zhi-Rong. Maximum ResidueLimit Standard of Veterinary Drug and Pesticide Residues in Food of Major Trade Countries and Regions. Beijing： Standards Press of China， 2004 葛志荣. 主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准. 北京： 中国标准出版社， 2004 7 EU Regulation（EC）No.396-2005 Pesticide EU-MRLs 8 GB 2763-2016， National Food Safety Standard Maximum Residue Limits for Pesticides in Food. National Standards of the People's Republic of China 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量. 中华人民共和国国家标准. GB 2763-2016 9 SHEN Rong-Ming， YANG Shao-Yun. Journal of Food Safety and Quality， 2016， 7（12）： 4982-4985 沈荣明， 杨韶芸. 食品安全质量检测学报， 2016， 7（12）： 4982-4985 10 ZHONG Zhi， LIU Qin， GU Bei-Qiao， LIU Shi-Zhong， GUO Yuan-Ming， CHEN Xue-Chang.Journal of Zhejiang Ocean University （Natural Science）， 2006， 25（2）： 196-199 钟 志， 刘 琴， 顾蓓乔， 刘士忠， 郭远明， 陈雪昌. 浙江海洋学院学报（自然科学版）， 2006， 25（2）： 196-199 11 QIU Wei-Fen， ZHANG Chang-Juan， WEN Liang， FANG Yong， HU Qiu-Hui.Food Science， 2015， 36（12）： 221-225 邱伟芬， 张昌娟， 文 良， 方 勇， 胡秋辉. 食品科学， 2015， 36（12）： 221-225 12 YANG Min， HAI Lai-An-Jia， LIU Fang， SONG Jian-Ping， LI Yang-Mei， TAN Wei， WANG Hong-Bin， LI Gui-Zhen. Journal of Yunnan University （Natural Sciences）， 2016， 38（3）： 464-470 杨 敏， 海莱安佳， 刘 芳， 宋建平， 李杨梅， 谭 伟， 王红斌， 李桂镇. 云南大学学报（自然科学版）， 2016， 38（3）： 464-470 13 HE Yun-Ya， ZHOU Lun-Min.Physical Testing and Chemical Analysis Part B：Chemical Analgsis， 2009， 45（6）： 717-718 何云亞， 周伦敏. 理化检验（化学分册）， 2009， 45（6）： 717-718 14 XIA Yu， WANG Yu-Ling， KONG Yu-Ming， LI Zi-Hua. Agrocheincals， 2017， 56（4）： 265-266 夏 禹， 王玉玲， 孔玉明， 李自华. 农药， 2017， 56（4）： 265-266 15 WEI Lin-Hong， WANG Lian， LIU Shu-Zhao.Scientia Agricultura Sinica， 2006， 39（5）： 941-946 韦林洪， 王 莲， 刘曙照. 中国农业科学， 2006， 39（5）： 941-946 16 WANG Yu-Jian， HUANG Hui-Ling， XUAN Kai-Zhi， CAI Wei-Kai， WANG Chun-Guang.Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2011， 30（5）： 77-80 王玉健， 黄惠玲， 禤开智， 蔡伟凯， 汪春光. 分析试验室， 2011， 30（5）： 77-80 17 ZHONG Ling-Li， HU Li， LEI Shao-Rong， GUO Ling-An， MAO Jian-Fei， LI Xi， YE Xian-Lin. Journal of Food Safety and Quality， 2016， 7（5）： 2081-2086 仲伶俐， 胡 莉， 雷绍荣， 郭灵安， 毛建霏， 李 曦， 叶先林. 食品安全质量检测学报， 2016， 7（5）： 2081-2086 18 JIN Yan-Jian， ZOU De-Yun， YAN Zhong-Yong， FANG Yi. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2016， 44（13）： 97-98 金衍健， 邹德云， 严忠雍， 方 益. 安徽农业科学， 2016， 44（13）： 97-98 19 WANG Xiao-Bin， WU Rui-Mei， LING Jing， LIU Mu-Hua， ZHANG Lu-Ling， LIN Lei， CHEN Jin-Yin. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2016， 36（3）： 736-742 王晓彬， 吴瑞梅， 凌 晶， 刘木华， 张庐陵， 蔺 磊， 陈金印. 光谱学与光谱分析， 2016， 36（3）： 736-742 20 LI Jun-Jie， ZENG Hai-Long， LIU Mu-Hua， WU Rui-Mei， WU Yan-Hong， WANG Xiao-Bin， CHEN Jin-Yin. Modern Food Science and Technology， 2015， 31（8）： 334-339 李俊杰， 曾海龙， 刘木华， 吴瑞梅， 吴彦红， 王晓彬， 陈金印. 现代食品科技， 2015， 31（8）： 334-339 21 FANG Cai-Wei， HE Fang-Yang， HUANG Jian， JIA Fang-Fang， LI Xing. China Brewing， 2016， 35（6）： 165-169 冯才伟， 何方洋， 黄 健， 贾芳芳， 李 行. 中国酿造， 2016， 35（6）： 165-169 22 JIN Ren-Yao， ZHU Guo-Nian. Acta Agriculturae Nucleatae Sinica， 2013， 21（4）： 515-522 金仁耀， 朱国念. 核农学报， 2013， 21（4）： 515-522 23 HUANG Jun-Ran， GE Ling， YE Zun-Zhong， WANG Jian-Ping. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（10）： 1483-1486 黄君冉， 盖 玲， 叶尊忠， 王剑平. 分析化学， 2010， 38（10）： 1483-1486 24 Gui W J， Wang S T， Guo Y R， Zhu GN. Anal. Biochem.， 2008， 377（2）： 202-208 25 Guo Y R， Liu S Y， Gui W J， Zhu G N. Anal. Biochem.， 2009， 389 （1）： 32-39 26 LI Pei-Wu， ZHANG Dao-Hong， ZHANG Qi， ZHANG Wen， DING Xiao-Xia， JIANG Jun， CHEN Xiao-Mei. China Patent， US2012/0034711A1， 2012 李培武， 张道宏， 张 奇， 张 文， 丁小霞， 姜 俊， 陈小媚. 中国专利， US2012/0034711A1， 2012 27 Zhang D H， Li P W， Zhang Q， Li R，Zhang W， Ding X X， Li C M. Anal. Chim. Acta， 2012， 740（17）： 74-79 28 Gui W J， Jin R Y， Chen Z L， Chen J L， Zhu G N. Anal. Biochem.， 2006， 357（1）： 9-14 29 HU Jing， GUO Yi-Rong， LIANG Xiao， LIU Xian-Jin， ZHU Guo-Nian， LIU Feng-Quan， WANG Ming-Hua， WANG Li-Min， HUA Xiu-De， ZHANG Cun-Zheng. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44 （12）： 1900-1906 胡 靜， 郭逸蓉， 梁 晓， 刘贤金， 朱国念， 刘凤权， 王鸣华， 王利民， 华修德， 张存政. 分析化学， 2016， 44（12）： 1900-1906 30 NY/T 761-2008， Pesticide Multirsidue Screen Methods for Determination of Organophosphorus Pesticides， Organochlorine Pesticides， Pyrethroid Pesticides and Carbamate Pesticides in Vegetables and Fruits. Agricultural Standards of the People's Republic of China 蔬菜和水果中有機磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定. 中华人民共和国农业行业标准.NY/T 761-2008 31 Shi C G， Zhao S Q， Zhang K， Hong G B， Zhu Z Y. J. Environ. Sci.， 2008， 20（11）： 1392-1397 Abstract A novel immunochromatographic assay was developed， which could provide visual evidence of triazophos in agro products， and also could directly identify the safety status by setting visual cut-off limit of detection in maximal residual limit （MRL） value. Three test lines （T1， T2， T3） were applied to the nitrocellulose membrane with different concentrations of Triazophos-OVA， and one control line （C） was settled with goat anti mouse IgG antibody. Thereafter， by combining with conjugate pad which immobilized monoclonal antibody labeled with 20 nm Colloidal gold particles， absorbent pad and PVC plate， a chromatographic test strip was assembled. With optimization of sample extraction and solvents selection， the test strips were employed for the determination of triazophos in rice， cabbage and apple. The results revealed that the cut-off limit of detection could reach 0.005， 0.01 and 0.02 μg/mL represented by test line T3， T2 and T1， respectively. After modification， the cut-off limit of detection was resettled to 0.05， 0.1 and 0.2 μg/mL according to the MRL values which enforced by the national standard of GB2763. Using acetonitrile for the sample extraction， the extracts were diluted 10 times or solvent exchanged with equivalent volume by PBS solution， and then tested by strips descripted above mentioned. The two test strips could precisely identified the safety status of agro product with MRL as threshold within 8-12 min. Furthermore， the residues value of triazophos could be quantified by the multiple quantitative test lines. Parallel GC data indicated that the strip had no false negative. This MRL-based multiple quantitative triazophos detection strip would provide a simple， direct， accurate and the most intuitionistic performance for the evaluation of agro product safety. Keywords Triazophos； Immunochromatographic assay； Maximal residual limit value； Rapid detection （Received 28 September 2017； accepted 24 March 2018） |
| 随便看 |
|
科学优质学术资源、百科知识分享平台，免费提供知识科普、生活经验分享、中外学术论文、各类范文、学术文献、教学资料、学术期刊、会议、报纸、杂志、工具书等各类资源检索、在线阅读和软件app下载服务。