| 标题 | 百草枯核酸适配体的筛选及其比色检测研究 |
| 范文 | 冉旭东 吴远根 摘 要 核酸适配体具有类似蛋白抗体的性质，在靶标特异性识别与检测中引起越来越广泛的关注。小分子物质通常与环境污染和人类健康密切相关，然而小分子物质与核酸文库在性质上差异较小，在筛选过程中没有足够的活性位点，难以固定，因而其核酸适配体筛选难度更大。本研究采用体外合成一条生物素修饰的碱基序列，通过氢键与随机文库3′-末端进行互补配对，将其固定在链霉亲和素修饰的纳米磁珠上。随后，加入不同浓度的百草枯靶分子孵育，洗脱得到百草枯特异性的亲和性ssDNA，对其进行非对称PCR扩增后，得到下一轮筛选所需的富集ssDNA库。经过9轮筛选后，将所得亲和性ssDNA进行克隆测序，最终得到15条百草枯的亲和ssDNA序列。对亲和性序列进行聚类分析和二级结构预测，再根据同源性等条件从中筛选出6条ssDNA序列进行亲和力测定。结果表明，PQ-15序列对百草枯的亲和力最高，解离常数（Kd）为（54±4） nmol/L。最后，利用PQ-15核酸适配体作为百草枯的识别分子，以阳离子化合物聚集的纳米金作为传感信号，建立了基于核酸适配体识别的百草枯农药比色检测方法，检出限为25.2 nmol/L，其它竞争性分子对百草枯检测无明显干扰，实际样品中百草枯的加标回收率为91.1%～99.6%。 关键词 核酸适配体; 百草枯; 筛选; 比色检测; 纳米金 1 引 言 百草枯（1，1-二甲基-4，4-二吡啶二氯）是一种具有双苯环结构、极性很强的有机小分子，是毒性最强的除草剂之一，在水中溶解度极高[1]。由于生产成本较低、除草效率高，因而被广泛应用于农业生产，曾在一些发展中国家广泛使用[2]。百草枯在食品中最大残留限量为0.05 mg/kg[3]，其毒性与二价阳离子还原及自由基有关，可引起细胞膜、蛋白质和DNA的损伤，从而对环境和人类健康造成潜在的威胁[4]。目前，由于缺乏特定的解毒剂和有效的治疗方法，已有数万例因百草枯中毒死亡病例报告。我国自2014年7月1日起撤销了百草枯水剂登记和生产许可，2016年7月1日全面停止水剂销售和使用，但仍有一些固体药物生产和非法使用。所以， 百草枯的檢测方法与治疗方法的研究对保护消费者健康具有重要意义。 核酸适配体是指具有10～100个碱基和特定复杂三维结构的单寡链核苷酸，1990年由Szostak[5]和Gold[6]等通过指数富集的配基系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 技术筛选获得。核酸适配体与靶标能发生特异性结合，亲和力极高，其结合解离常数通常可以达到纳摩尔和皮摩尔级[7]。小分子有害污染物与人类健康密切相关，但针对小分子靶标的核酸适配体筛选方法还存在许多不足，如受到靶标分子量以及材料特性制约，筛选平台自动化程度不高、随机性较大，针对不同的靶标需不同的筛选策略。通常，核酸适配体筛选成功与否主要取决于靶标与ssDNA孵育结合及后续的分离纯化[8]。研究人员建立了一些新的筛选技术，如毛细管电泳（CE）[9]、流式细胞仪（FC）[10]、表面等离子体共振（SPR）[11]、磁珠分离法[12] 、微流控筛选法[13]、氧化石墨烯[14]等，主要对SELEX程序进行了改进，以便快速、简单地筛选与各种靶标及其类似物结合的核酸适配体[15]。随着近些年来核酸适配体筛选技术的快速发展，研究人员已经筛选出针对生物毒素、重金属、抗生素、农药等小分子的核酸适配体，其中农药类核酸适配体主要有啶虫脒[16]、莠去津[17]、甲拌磷、水胺硫磷、氧化乐果[18]、苯噻草胺、戊唑醇、抗倒胺[14]、氟虫腈[19]，但针对百草枯核酸适配体的筛选及检测目前还未见报道。针对百草枯的检测方法主要有免疫分析法[20]、高效液相色谱法[21]、色谱质谱联用法[22]、高效毛细管电泳法[23]等。这些检测方法使用仪器价格昂贵，样品前处理繁杂，检测时间长，且需要专门的操作人员，不利于现场实时检测，所以有必要建立一种百草枯快速灵敏的检测方法。 本研究在课题组前期报道的筛选方法[8]基础上加以改进，采用磁分离技术对亲和性ssDNA序列有效分离，采用非对称PCR进行扩增，经过9轮筛选后，成功获得15条百草枯的亲和ssDNA序列，并通过一系列测定，从中挑选出亲和力最强的序列作为识别分子，建立了一种基于核酸适配体和阳离子聚合物聚集纳米金比色技术的百草枯快速检测方法。此检测方法具有快速、可裸眼辨别、灵敏度高、成本低且易操作的优势。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 PTC-200型PCR仪（美国MJ RESEARCH公司）; PowerPa伯乐小型电泳仪（美国BIO-RAD公司）; Milli-Q plus型恒温孵育器（Millipore Inc， Bedford， MA）; 多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）; 高速冷冻离心机（美国Sigma公司）。 随机单链寡核苷酸库5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-N30-AGTATGAGCGAGCGTTGCG-3′、PCR引物P1（5′-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3′）、P2（5′-CGCAACGCTCGCTCATACT-3′）、生物素标记的寡聚核苷酸序列P3（5′-Biotin-CGCAACGCTCGC-3′）、寡聚核苷酸纯化试剂盒、非变性电泳凝胶试剂盒、PCR扩增试剂盒、Marker、纯化回收试剂盒和5×TBE（上海生工生物工程股份有限公司）; 链霉亲和素磁珠（南京先丰纳米材料科技有限公司）; 双丙烯酰胺（Bis）、丙烯酰胺（Acr）、过硫酸铵、异丙醇、溴酚蓝、AgNO3、甲醛溶液、百草枯标准液（浓度为100 μg/mL）、柠檬酸三钠、氯金酸（HAuCl4）、聚二烯二甲基氯化铵（PDDA）、3-（N-吗啡啉）丙磺酸（MPOS）等（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; NaCl、Tris·HCl、KCl、MgCl2·6（H2O）、CaCl2 、Tween-20和甘油等化学试剂均为市售分析纯，购于上海国药集团化学试剂公司; 实验用水均为双蒸水。 2.2 实验方法 2.2.1 核酸适配体的体外筛选步骤 百草枯核酸适配体的筛选步骤：（1） 随机ssDNA的固定 取3 nmol的随机ssDNA库，按摩尔比1∶2与P3序列混合，95℃退火5 min，30℃孵育60 min，使随机文库的3'端12个碱基序列与P3通过氢键互补配对。将配对后的混合液移入装有磁珠的离心管中，30℃孵育60 min， 由于磁珠表面接有链霉亲和素，通过生物素-亲和素作用，将随机文库固定在磁珠上。用Binding 缓冲液（BB， 100 mmol/L NaCl， 20 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L KCl， 2 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L CaCl2， 0.02% Tween-20，pH=7.4）洗涤，除去未固定的随机文库和P3。（2）ssDNA序列的洗脱 在第1轮筛选时，取终浓度为500 μmol/L的百草枯溶液加入到固定随机文库的磁珠中。为了使靶标百草枯与固定的随机文库充分作用，进一步提高适配体筛选成功率，根据文献[18]报道，本实验将百草枯农药与固定的随机序列轻微振荡5 min混匀，30℃孵育60 min后，于4℃過夜孵育。将上述磁珠用磁铁充分分离，收集百草枯洗脱的ssDNA上清液，用酶标仪测定吸光度，计算洗脱率。在后续的SELEX筛选过程中，百草枯终浓度由500 μmol/L逐渐减少至50 μmol/L，其它操作与第1轮均相同。（3）非对称PCR扩增 利用本课题组前期优化的非对称PCR程序，扩增百草枯洗脱的亲和性序列。反应溶液体系按照下述配方配制。PCR扩增反应液500 μL，包含200 μL模板链（即百草枯亲和性ssDNA序列）、37.5 μL 10 μmol/L P1引物、7.5 μL 1 μmol/L P2引物和250 μL 2X PCR Master，将上述反应液用无菌ddH2O补加至500 μL，混合均匀后，等量分装到10个PCR管中，进行PCR扩增。非对称PCR扩增条件为： 94℃，3 min （变性）; 20个快速三阶段PCR循环（94℃，45 s; 51℃，30 s; 72℃，20 s）; 在72℃延伸反应5 min。（4）凝胶电泳分离和ssDNA纯化回收 经非对称PCR扩增后，取每轮的扩增产物9 μL，各加入1 μL溴酚蓝上样缓冲液混匀，1×TBE作为电泳缓冲液，用16%的非变性PAGE凝胶进行电泳分离，电压控制在100～120 V。电泳结束后， PAGE胶银染。在下一轮百草枯核酸适配体筛选实验前，利用寡聚核苷酸纯化试剂盒对本轮得到的PCR扩增液进行纯化。 2.2.2 百草枯核酸适配体克隆测序及二级结构预测 经过9轮的SELEX筛选，对最后收集到的百草枯亲和性序列进行PCR扩增，并将扩增反应液送到上海生工生物股份有限公司进行纯化和克隆测序。所有测序的序列用MEGA（Molecular evolutionary genetics analysis）软件制作发育树，二级结构通过http：//mfold.rna.albany.edu/网站进行预测。 2.2.3 核酸适配体解离常数（Kd）的测定 根据同源性及二级结构等综合分析，选出一些百草枯亲和序列进行FAM荧光标记。然后分别配制10 μmol/L的适配体亲和序列与20 μmol/L生物素标记的P3序列，按照摩尔比1∶2混匀、变性后，60℃孵育60 min。用250 μL BB缓冲液洗涤磁珠3次，用200 μL BB缓冲液重悬磁珠，备用。将亲和序列替代随机文库作为对照，取重悬的磁珠分别与P3和适配体亲和序列杂交溶液进行混合孵育120 min。用BB缓冲液洗涤除去未固定的亲和序列和P3，总体积控制在1500 μL。测定收集洗脱液的荧光强度，并计算亲和序列的固定量（X）。将上述固定有亲和序列的磁珠分散到适量BB溶液中，取终浓度为100 μmol/L靶标溶液，与固定了百草枯亲和序列的磁珠在60℃孵育120 min， 4℃过夜孵育，洗脱。取200 μL上清液，放入黑色酶标板中，测定洗脱液的荧光强度，计算得到与百草枯结合并被洗脱下的亲和序列浓度（Y）。通过Origin8.0软件进行曲线拟合，拟合公式为 Y=BmaxX/（Kd+X）， 其中，Y为核酸与靶标的复合物浓度; X为固定的核酸浓度; Bmax为常数; Kd为解离常数（亲和系数）。 2.2.4 AuNPs比色法检测百草枯 （1）纳米金的制备 利用“柠檬酸三钠还原氯金酸法”制备纳米金[24]。称取 33.98 mg HAuCl4·xH2O 和114.11 mg 二水柠檬酸三钠，分别溶解在100 和10 mL双蒸水中。加热氯金酸溶液至沸腾，在剧烈搅拌过程中迅速加入10 mL的柠檬酸三钠溶液，保持加热15 min，溶液由淡灰色变成蓝色，再渐变为紫色，直至变为稳定的酒红色后，停止加热。持续搅拌15 min，冷却至室温。将上述溶液用250 nm孔径的超滤膜进行过滤，滤液于棕色瓶中在4℃储存，备用。（2） 基于AuNPs比色检测百草枯 选取亲和性最高的序列作为百草枯的识别分子，参照课题组前期建立检测方法[25]，以阳离子化合物聚集纳米金为传感信号，比色检测百草枯。在整个传感体系中，PDDA和适配体浓度对纳米金聚集具有调控作用，因此需对体系中的PDDA和适配体用量进行优化。分散态的纳米金在520 nm有最大吸收峰，聚集时在650 nm有最大吸收峰，因此取200 μL反应液放入96孔板中用酶标仪，测定吸光值A520 nm和A650 nm，以A650/520表示纳米金聚集程度，靶标与空白组A650/520的差值△A650/520作为检测信号。（3）百草枯核酸适配体的性能分析 将亲和性最强的序列与不同浓度的百草枯孵育，在优化的条件下进行灵敏度测定。随后选取甲拌磷、啶虫脒、敌敌畏、辛硫磷、丙溴磷、甲基对硫磷作为竞争性靶标，验证本方法对百草枯检测的特异性，对比各自颜色变化情况，记录各类靶标与空白平行组溶液的吸光差值△A650/520。采集贵州大学阅湖水（北纬26°26′47″， 东经106°39′24″）作为样品一，稻田水（北纬26°26′55″， 东经106°41′16″）为样品二，果蔬地土壤（北纬26°26′49″， 东经106°39′45″）为样品三，在上述实际样品中分别加入500和1000 nmol/L百草枯标准液，利用本方法测其回收率。 3 结果与讨论 3.1 百草枯核酸适配体的筛选 由于本研究组前期利用19个碱基的引物与文库杂交[8]，导致靶标洗脱的亲和序列不多，所以本实验根据文献[26]的思路设计了12个碱基的引物P3。百草枯核酸适配体的筛选具体流程如图1A所示，首先将ssDNA随机文库与生物素修饰的P3序列通过碱基互补配对，按摩尔比1∶2混匀，经退火处理后与链霉素亲和素修饰的纳米磁珠结合，再加入百草枯靶标洗脱具有亲和力的ssDNA序列。根据洗涤下来的ssDNA量/固定在磁珠上的ssDNA量，计算每轮筛选的洗脱率。由于百草枯的吸收峰与核酸分子在260 nm处的吸收峰较接近，所以在计算洗脱率时排除百草枯自身的干扰。如图1B所示，在相同百草枯浓度下，随筛选轮数的增加，洗脱率越来越大; 逐渐减小靶标浓度，百草枯洗脱下来的序列亲和性越来越强。经过前9轮筛选，发现50 μmol/L百草枯对固定亲核性序列的洗脱率达到22.3%。对9轮筛选得到的非对称PCR扩增液进行电泳与凝胶染色处理，其结果如图1C所示。前兩轮电泳由于引物二聚体、非特异性扩增等因素导致产物不纯，条带出现混杂现象。其后扩增产物逐渐形成单一条带，表明ssDNA序列纯度逐渐提高，亲和力越来越强，且每轮条带均在50～100 bp之间，完全符合文库设计范围。 3.2 百草枯核酸适配体序列分析 根据本研究组前期研究结果 [8]和文献报道，通常固定文库法筛选适配体时， 靶标对固定序列的洗脱率在20%～30%。本实验考虑筛选效率以及其它不确定性等因素，最终对第9轮筛选后的百草枯亲和序列进行PCR扩增，并委托上海生工生物有限公司进行克隆，然后挑选克隆子进行测序，最终获得15条与文库碱基数一致的亲和序列，并分析了它们随机区域的碱基组成与分布，所有结果见表1。通过MEGA软件进行发育树分析（图1D），进一步分析随机序列组成与百草枯结合的关系。对15条亲和序列的随机区域进行比对后发现，PQ-1和PQ-3序列随机区都出现了保守序列“CGGGTGG”，PQ-4和PQ-7随机区都出现了保守序列“GAC”“CAA”序列片段，且所有序列的CG含量都比较高，因而推测百草枯分子与亲和序列的结合能力，可能与百草枯分子和亲和序列中的CG形成稳定的次级键有关。 根据CG含量高、结构稳定及自由能低等因素，挑选6条亲和序列（PQ-7、PQ-8、PQ-12、PQ-13，、PQ-14和PQ-15），用Mfold软件进行二级结构预测，结果如图2所示。根据预测，这些序列的二级结构主要以茎环为主，环上均出现了T=G错配，这些茎环可能是亲和序列与百草枯结合的结构基础，茎环结构中的茎可能起到稳定结构的作用，环则通过氢键、疏水作用、碱基堆积等发生结构上的变化，形成高度结构化与百草枯结合的位点。 3.3 核酸适配体的解离常数（Kd）测定 3.4 AuNPs聚集比色检测百草枯原理及条件优化 利用PQ-15序列作为百草枯的识别分子，选择阳离子聚合物PDDA调控的AuNPs聚集作为信号输出，建立了基于核酸适配体的百草枯检测方法，检测原理如图4A所示。PDDA水溶液具有高密度正电荷，基于静电吸引使金纳米粒子聚集，颜色由红色变成蓝色。由于适配体磷酸骨架基团带有负电荷，PDDA可以与PQ-15适配体通过静电吸附形成“Duplex”结构，此时PDDA被消耗从而不会使后续加入的AuNPs聚集，因而整个体系展现出红色，并在520 nm处有最大吸收峰（图4B）。当体系中存在百草枯时，其先与PQ-15适配体发生亲和作用形成复合物，后续再加入PDDA后会导致AuNPs聚集，此时整个体系展现出蓝色，并在650 nm处有最大吸收峰，这种变化趋势与百草枯浓度（500和1000 nmol/L）呈现正相关（图4B），因此可用于百草枯的比色检测。由于纳米金的聚集程度与PQ-15适配体和PDDA的浓度相关，在前期预实验基础上，选取1～20 nmol/L的PQ-15和5～25 nmol/L的PDDA进行优化，以A650/520表示纳米金聚集程度与空白组纳米金A650/520的差值△A650/520作为检测信号。如图4C所示，PDDA浓度为20 nmol/L达到最佳饱和状态，少量PDDA不会使纳米金完全聚集，而过多PDDA会导致更高的背景信号，降低传感体系的灵敏度。在最佳PDDA浓度下， PQ-15核酸适配体浓度为5 nmol/L时，检测信号达到最大值，适配体的使用量过高或过低都会影响PDDA对纳米金的聚集（图4D）。 3.5 AuNPs聚集比色法检测百草枯性能分析 采用已优化的条件，在体系中加入50～2000 nmol/L百草枯，空白组则用双蒸水代替，通过酶标仪测定实验组与空白组A650/520的吸光差值△A650/520作为检测信号。如图5A所示，体系的的颜色随百草枯浓度增加逐渐变蓝，浓度增加到500 nmol/L时，颜色基本达到饱和。△A650/520与百草枯浓度在50～500 nmol/L范围内具有良好的线性关系，回归方程为△A650/520=0.843×104x+0.108 （R2=0.994）。根据本研究组前期报道[25]，通过3σ/slope计算得到检出限为25.2 nmol/L（≈6.48 μg/L），低于中国农业部制定的果蔬产品中百草枯最大残留量标准（50 μg/L）。分别选取甲拌磷、啶虫脒、敌敌畏、辛硫磷、丙溴磷、甲基对硫磷作为竞争性农药，采用本方法测定，结果表明，检测体系中存在百草枯时，纳米金发生聚集变蓝，而加入其它农药的样品组中纳米金均保持红色，PQ-15适配体对百草枯的检测信号明显高于其它竞争性农药。当竞争性靶标中加入同等浓度的百草枯后，检测信号又恢复（图5B），说明PQ-15适配体能特异识别百草枯农药，且其它农药对百草枯的检测不产生干扰。 4 结 论 通過磁分离，经过9轮筛选获得百草枯的高亲和性寡聚核苷酸。将所得到的亲和序列进行克隆测序，得到15条完整序列。用MEGA和Mfold 软件分析发育树和二级结构，发现所得序列大多为茎环结构。对亲和序列进行亲和力表征，百草枯核酸适配体PQ-15具有很强的亲和性（Kd=（54±4） nmol/L），但百草枯与其适配体的结合机理还有待进一步探索。以亲和序列作为百草枯的识别分子，以阳离子化合物聚集的纳米金为传感信号，建立了基于核酸适配体识别的百草枯农药比色检测方法，检出限为25.2 nmol/L。本方法具有快速、灵敏、低成本且易操作的优势，可用于实际样品中百草枯的检测。 References 1 Taguchi V Y， Jenkins S W D， Crozier P W， Wang D T. 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