| 标题 | 基于电喷雾-四极杆-飞行时间质谱的神经节苷脂的结构解析 |
| 范文 | 张华林 郭志谋 王联芝 金高娃 邹丽红 吕园园 马明辉 闫竞宇 段正超 梁鑫淼 摘?要?神经节苷脂（Ganglioside）是一种含有唾液酸的鞘糖脂化合物，是脊椎动物细胞膜的天然成份，具有广泛的生理功能。对神经节苷脂进行结构鉴定，有助于深入了解药物的组成，提高药物的品质，但由于神经节苷脂结构复杂，异构体众多，质谱规律变得多样且复杂。本研究建立了一种利用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱的（ESI-Q-TOF-MS）解析神经节苷脂结构的方法。通过两个神经节苷脂对照品，优化质谱参数并总结质谱规律，建立质谱方法为：正离子模式; 3500 V毛细管电压; 200 V Fragmentor电压; 用40 eV的碰撞能获得糖链的碎片结构， 用80 eV的碰撞能获得神经酰胺的碎片结构。将本方法应用于制备的9个神经节苷脂的结构解析中，通过与对照品分子量对比，对样品进行简单的归属和分类，再根据样品的二级质谱中的特征碎片进行详细的结构解析。本研究结果表明，本方法可用于各类神经节苷脂的质谱鉴定中，为更复杂的神经节苷脂质谱解析奠定了基础。 关键词?神经节苷脂; 电喷雾-四极杆-飞行时间质谱; 结构解析 1?引 言 神经节苷脂（Ganglioside）是一类含有唾液酸的鞘糖脂化合物，最初是由E.Klenk在患家族黑蒙性痴呆病（Tay-Sachs）的幼儿大脑中发现。由于在脑灰质细胞中含量最高，于是将这类含唾液酸的鞘糖脂命名为神经节苷脂。神经节苷脂在正常細胞的生长、分化、调节及信息传递过程中发挥着重要作用，尤其是在神经元的成熟和损伤神经的修复再生过程中的作用备受关注，同时，神经节苷脂在临床上也具有很高的价值[1～5]?，如治疗帕金森病、阿尔兹海默病、亨廷顿病等神经性疾病。神经节苷脂由亲水性的寡糖链部分和亲脂性的神经酰胺（Ceramide，Cer）组成。寡糖链的单糖种类常包括D-葡萄糖（Glucose，Glc）、D-半乳糖（Galactose，Gal）、N-乙酰氨基半乳糖（N-acetylgalactosamine， GalNAc）、岩藻糖（Fucose，Fuc）和唾液酸（N-Acetylneuraminic acid，NeuAc）。神经酰胺结构中包含一条脂肪酸链（Fatty acid chain）和一条鞘氨醇链（Sphingosine）。不同的单糖组成、数目和神经酰胺链的长度组成了一系列神经节苷脂类化合物，据报道，在人脑病变组织中已发现和鉴定了73种神经节苷脂[6]。为更加简单表述这类物质，Svennerhnolm创立了一个通俗命名规则[7]。G代表神经节苷脂，大写A、M、D、T、Q、P、H和S分别表示所含的0～7个唾液酸基团数目，数字为5与糖基数之差，小写字母a，b，c表示唾液酸不同的连接位置。神经酰胺的结构通常在糖链后的括号内注明，如GM1（d 18∶1/18∶0），字母d表示在神经酰胺中有2个羟基，18∶1描述的是鞘氨醇的结构，表示在鞘氨醇中有18个碳原子和1个双键，18∶0是脂肪酸链的结构，表示在脂肪酸链中有18个碳原子且没有双键。本研究为了方便表示化合物结构，神经酰胺部分直接以该部分的分子量表示，如GM1（565）表示该单唾液酸四己糖神经节苷脂的神经酰胺部分的分子量为565。 电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（Electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrome，ESI-Q-TOF-MS）具有分辨率高、采样速度快的优点，全扫描方式检测的离子质量准确度比一般的质谱高100倍以上[8]，在推断化合物结构方面具有无可比拟的优势，并且能选定一级质谱中的目标物进行二级质谱分析，更有利于解析化合物的结构。目前已有许多采用液相色谱-质谱联用的方法分析神经节苷脂的报道[9～21]。2010年，Zarei等[10]利用纳升高效液相色谱（nanoHPLC）和电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ESI-QTOF/MS）在线结合，用于分析YAC-1淋巴瘤细胞单唾液酸神经节苷脂，发现YAC-1细胞系可表达GM1b和GalNAc-GM1b类型的神经节苷脂。2012年，Lee等 [11]利用纳升液相色谱-芯片/质谱（nano-HPLCchip Q-TOF/MS）建立了极性脂质分析方法，分析了小鼠脑的极性脂质，发现其含有17种神经节苷脂和13种硫苷脂。2017年，Hajek等 [22]将亲水相互作用液相色谱（HILIC）与负离子电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）方法相结合，用于猪脑、人肾、肺、血浆和红细胞中的神经节苷脂的分析，鉴定了145种神经节苷脂，该方法具有通量高、灵敏度高等优点。尽管这些研究在神经节苷脂分析中取得了较好的进展，但多数研究集中在利用该方法对动物或人的器官和组织中神经节苷脂的轮廓分析，利用Q-TOF方法研究神经节苷脂的质谱碎裂规律的工作未见文献报道。本研究利用两个已知结构的神经节苷脂对照品进行质谱条件的优化及特征碎片的归属研究，在此基础上，对制备得到的一系列的神经节苷脂进行质谱结构解析和鉴定，最后对神经节苷脂的断裂规律进行了总结，为解析复杂的神经节苷脂结构提供了理论依据。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 Agilent 1290 infinity和6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS（Agilent Technologies公司），质谱数据分析软件采用Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.04.00; XS105天平（Dual Range公司）。 甲醇（色谱纯，Merck公司）; 乙腈（色谱纯，Sigma公司）; 氯仿（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）; 神经节苷脂对照品GM1（d18∶1/18∶0）和GM1（d18∶1/20∶0）由齐鲁制药有限公司提供，纯度≥99%; 其余神经节苷脂样品由实验室自制，纯度≥98%。实验用水为Milli-Q超纯水。 2.2?实验方法 准确称取各单体1 mg， 溶于1 mL氯仿-甲醇-水（25∶25∶8， V/V）中，取出100 μL，再用900 μL氯仿-甲醇-水（25∶25∶8， V/V）稀释， 配制成100 μg/mL的溶液。（1）液相色谱条件?流动相为0.1%甲酸-乙腈（50∶50，V/V），流速0.2 mL/min，进样量为0.5 μL（无色谱柱，二通连接）。（2）质谱条件?正离子模式，毛细管电压为3500 V，干燥气温度为350℃， 气体流速为8.0 L/min。Fragmentor电压参数的设置参见结果与讨论部分。一级质谱扫描范围为m/z 300～2000，二级质谱的扫描范围为m/z 100～2000。在开展质谱的二级碎裂时，手动设定一级质谱获得的丰度最高的质荷比为前体离子，通过改变不同的碰撞能进行谱图优化。 3?结果与讨论 3.1?神经节苷脂分子量的测定及结构的简单归属 神经节苷脂结构复杂，结构相似物多，分离纯化存在较大的挑战，本实验室在前期工作中通过多维制备液相色谱从猪脑粗提物中分离得到系列单体化合物。本研究选择其中具有代表性的9种化合物，利用一级质谱对其进行分子量测定，通过与对照品GM1（565）和GM1（593）分子量比对，根据分子量的变化进行简单的归属和分类。如样品的分子量与对照品分子量差值为291及291的倍数，认为是唾液酸数目的增减; 与对照品分子量相差146及146的倍数，认為是岩藻糖数目的增减; 与对照品的分子量相差14及14的倍数，则可能是脂链部分发生了变化。表1给出了本研究涉及的11种神经节苷脂化合物的信息。化合物1和2分别为两个单唾液酸四己糖神经节苷脂对照品GM1（565）和GM1（593）。化合物3～7与对照品相比，分子量的差异大，且除化合物3外都是唾液酸数目的增减，可根据之前的命名规则将其直接归属，其中化合物5和6是同分异构体，分别用后缀区分两种化合物。化合物3与GM1（593）相比，相差146，推测是糖链部分增加了一个岩藻糖。化合物8～11与对照品分子量差异小，不可能是糖链的结构差异引起的，因此推测其神经酰胺部分发生了变化。 3.2?质谱条件的优化 3.2.1?优化质谱离子模式?在质谱分析中，尤其是二级质谱，质谱条件的设置对于获取特征碎片信息具有重要影响，因此针对所使用的质谱特点，优化质谱参数，获得更多的碎片信息是本研究优先考虑的问题。本研究采用Agilent Technologies 6540质谱仪，对毛细管电压、离子模式、碎裂电压和碰撞能等重要参数进行优化。 首先对质谱离子模式进行优化，结果见电子版文后支持信息图S1A和S1B，负离子模式获得的离子碎片明显少于正离子模式获得的碎片。考虑到碰撞能的影响，加大碰撞能到80 eV（电子版文后支持信息图S1C和S1D），正离子模式下所获得的离子碎片明显比负离子模式下获得的离子碎片多。由此确定，在正离子模式下会获得更多的离子碎片峰，更有利于对神经节苷脂的结构解析。 3.2.2?优化碎裂电压?考察了GM1（565）在不同的碎裂电压下的电离和碎裂情况，结果如电子版文后支持信息图S2所示，在正离子模式、毛细管电压为3500 V、碰撞能为40 eV，以及进样量一致的条件下，碎裂电压为30、50和100 V时，母离子m/z 1568.9（加钠峰）的丰度都偏低; 碎裂电压为150、175和200 V时，母离子丰度比较适中，且差异很小。本实验选择碎裂电压为200 V的条件下，对神经节苷脂进行裂解。 3.2.3?碰撞能的优化?二级质谱是通过选择特定质荷比（m/z）的母离子，在仪器中利用诱导碰撞电压（CID）进行碎裂，得到二级质谱图。碰撞电压过小，会使母离子断裂不够明显，获得的碎片少、丰度低，影响化合物推断; 碰撞电压过大，碎裂过于严重，也不利于解析结构。神经节苷脂结构中包含易发生碎裂的糖链结构和不易碎裂的神经酰胺结构，希望通过调整碰撞能既可获得糖链的结构也可获得神经酰胺结构，因此，对碰撞能进行了详细的优化。 为了观测到神经节苷脂中糖链的结构组成，采用对照品GM1（565）在正离子模式、毛细管电压为3500 V、碎裂电压为200 V、进样量一致的条件下，分别考察碰撞能为20、30、40 和50 eV时糖链碎片的丰度，结果如电子版文后支持信息图S3所示。在碰撞能为20 eV和30 eV时，母离子m/z 1568.9（加钠峰）丰度较高，其余各碎片离子丰度较低; 当碰撞能增加至40和50 eV时，母离子m/z 1568.9（加钠峰）丰度显著降低，故本研究选取40 eV的碰撞能对糖链进行检测。神经节苷脂中不易碎裂的神经酰胺结构需要在较高的碰撞能下才能裂解[26]，分别考察碰撞能为60、70、80和90 eV时的结果（如电子版文后支持信息图S4所示），神经酰胺（m/z 548）的丰度随着碰撞能增加，碎片离子m/z 264的丰度逐渐增加，m/z 548的丰度逐渐降低，故最终选取80 eV作为碎裂神经酰胺的碰撞能。 对质谱各参数影响的考察后，确定测定神经节苷脂的质谱条件为正离子模式，毛细管电压为3500 V， 碎裂电压为200 V，用碰撞能40 eV的测定糖链的结构，用80 eV的碰撞能测定神经酰胺的结构。 3.3?对照品质谱碎片归属 3.3.1?GM1（565）质谱碎片归属?由神经节苷脂的结构可知，GM1的糖链部分含1个唾液酸和4个单糖组成。 为方便进行质谱推断，图1标识了对照品GM1（565）（即GM1（d18∶1/18∶0））结构中各组成部分的分子量[9]。在优化条件下，GM1（565）在40和80 eV碰撞能下的实验谱图见图2。在40 eV碰撞能下（图2A），可依次看到分子离子峰、失掉唾液酸和糖单元的峰及神经酰胺失水峰等，这些特征碎片很好的展示了糖链结构。在80 eV碰撞能下（图2B），除糖链部分的结构外， 有个较为明显的碎片峰为m/z 264， 通过查阅文献[24，25]，其形成与鞘氨醇结构有关（表2中R所示），通过其碎片可推测出神经酰胺的结构。表2详细归属了GM1（565）在优化质谱条件下产生的碎片结构。 3.3.2?GM1（593）质谱碎片归属?为进一步考察神经节苷脂在此条件下的裂解规律，再次用另一个对照品GM1（593）进行验证。图S5A显示，在40 eV碰撞能下，GM1（593）谱图与GM1（565）谱图一致，说明二者都含有单唾液酸四己糖结构。图S5B中清晰可见m/z 264峰，说明神经酰胺中鞘氨醇的结构两个对照品是一致的，主要差异来源于脂肪酸链的不同，与GM1（565）相比，GM1（593）在脂肪酸链上有两个碳的延长，其余结构都一致。推测结果与GM1（593）的实际结构完全一致，表明本方法可用于神经节苷脂类物质的结构推测。电子版文后支持信息表S1对GM1（593）的主要碎片进行了归属。 3.3.3?解析糖链发生变化的神经节苷脂?通过一级质谱可知，化合物3～7与GM1（593）相比，主要是糖链上发生了变化。以高碰撞能对这些化合物进行裂解，发现其神经酰胺产生的碎片结构与GM1（593）一致，均为d18∶1/20∶0的结构，再一次证明主要差异来自于糖链部分。在优化后的条件下，上述神经节苷脂的糖链质谱以及对照品GM1（593）糖链部分谱图见图3A。在糖链变化中比较容易推断结构的是糖数目和种类的变化，如GA1（593）（图3B）和Fuc-GM1（593）（图3C），较难推断的是异构体及多个唾液酸时唾液酸的连接位置和连接方式，在本研究中将重点讨论异构体GD1（593）-1（图3D）和GD1（593）-2（圖3E）异构体的结构推断，以及GT1（593）中3个唾液酸的连接位置和方式。对比图3D和3E，谱图差异性较大，在图3E中m/z 583碎片是2个唾液酸通过α-2，8连接键首尾相连的特征碎片，说明GD1（593）-2中2个唾液酸是在连在一起的，结合其它碎片，可进一步归属其为GD1b的糖链结构。在图3D中未发现m/z 583特征碎片，说明两个唾液酸未连在一起，同时m/z 657显示其中1个唾液酸与末端半乳糖相连，由此推断出GD1（593）-1中糖链的结构为GD1a。同理可以推测出GT1（593）中的糖链结构为GT1b。上述糖链变化的神经节苷脂糖链碎片归属及推测得到的化合物精确结构见表3。 3.4?解析神经酰胺链发生变化的神经节苷脂 如前所述，推测神经节苷脂化合物8～11与对照品相比主要是神经酰胺部分发生了变化。通过标准品质谱裂解规律可知，在80 eV的碰撞能下，可根据鞘氨醇链的特征碎片m/z 264推断出神经酰胺的结构。4种化合物的该部分结构的质谱见图4。在图4A和4B中均可见特征碎片m/z 264，说明GM1（607）和GM1（621）的鞘氨醇链未变化，神经酰胺结构的改变主要发生在脂肪酸链上的碳数目的延长上。在图4C和4D中未见m/z 264特征碎片，但都有m/z 284的未知碎片，同时，GM1（567）、GM1（595）与对照品GM1（565）、GM1（593）相比，分子量分别增加了2，推测其是鞘氨醇部分的双键被还原。通过与文献[26， 27]比对，m/z 284确定为鞘氨醇链的双键被还原后产生的特征碎片，具体结构见图4，表4列出了神经节苷脂8～11的特征碎片的精确结构。 4?结 论 建立了一种基于ESI-Q-TOF-MS的神经节苷脂类化合物结构解析方法。在优化条件下获取对照品的特征碎片及裂解规律，进而将此裂解规律应用到制备得到的9种神经节苷脂的结构解析中。制备得到的神经节苷脂与对照品相比，有些化合物在糖链部分发生了变化，例如唾液酸和岩藻糖的个数、位置的变化，有些化合物在神经酰胺链上发生了变化，如脂肪酸链碳数目和鞘氨醇链饱和程度，均具有一定的代表性。在对这些化合物质谱解析中，发现和总结了不同类型神经节苷脂独特的结构碎片，为更复杂的神经节苷脂的质谱解析奠定了基础。 References 1?YUAN Chun-Li. 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