| 标题 | 基于质谱断裂机理的乳制品中农药非定向筛查分析方法构建 |
| 范文 | 贾玮 张荣 石琳 张峰 许秀丽 储晓刚 摘?要?采用数据依赖型采集质谱技术，对585种农药标准物质的化合物分子离子质荷比、二级碎裂片段的质荷比与保留时间等进行研究，建立了农药残留标准数据库，并对8类100种农药进行片段断裂机理研究，得到不同类别农药的特征断裂片段。将特征断裂片段与农药残留标准数据库相结合，基于数据非依赖采集质谱技术，构建非定向筛查方法，方法检出限和检测容量分别为0.001～539 μg/kg与0.001～899 μg/kg，回收率与相对标准偏差分别为77%～113%和0.1%～8.3%。将所建立方法用于市售93个批次巴氏杀菌乳与超高温瞬时灭菌乳中农药的非定向分析，发现样品中含有前期未检出的嘧菌酯与草克乐，含量分别为2.3和6.1 μg/kg。建立的非定向筛查分析方法可为快速筛查鉴定乳制品中农药提供有效的技术手段。 关键词?非定向筛查; 超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱; 乳及乳制品; 农药残留 1?引 言 因上游规模化养殖加速、人口结构变化、消费结构升级等原因，乳制品消费量持续增长，其质量与安全问题也更受关注[1，2]，而农药残留是影响乳制品质量的重要因素[3]。非定向技术筛查食品中相关化学危害物是我国“十三五”规划中前沿技术之一[4]，旨在鉴定样品中未知化合物，在海量的数据中进行筛选与确证，同时运用化学计量学方法进行数据处理[5]。非定向筛查是基于高分辨质谱的数据非依赖采集（Data independent acquistition，DIA）模式，在一级扫描中均匀地采集质荷比范围内每个窗口的待分析物信息，具有较高的准确性和可重复性[6～8]。但因其信息采集窗口较大，进入二级质谱的片段较多，产生复杂的碎片离子，不利于后续的数据分析[9]。开发可变的数据非依赖采集（Varible data independent acquistition， vDIA）方法，可根据目标物质所分布的质荷比范围，动态调整各个窗口的大小，以提高选择性与扫描速度[10，11]。 乳制品产业链长，在饲料种植过程中大量使用除草剂、杀虫剂、植物生长调节剂等农药，以提高产量[12～15]，农药通过食物链与生物富集作用进入生乳中[16，17]。在后续热加工中，农药及其残留率会有所变化[18，19]。传统的全扫描数据依赖筛查（Full MS/dd-MS2）依据MS/MS片段，只允许在目标清单范围内识别农药残留[20～22]，所以有必要采用非定向技术筛查乳制品的农药及其残留产物，且目前大多数农药特征断裂片段在m/z 200～500的范围内，因此，调整此范围窗口的大小，可提高方法的选择性。 本研究利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱质谱（UHPLC-Q-Orbitrap MS）技术， 在Full MS/dd-MS2扫描模式下建立农药残留标准数据库，同时将已知农药特征断裂片段应用于乳制品非定向农药筛查技术中，使用Full MS/vDIA扫描模式对实际样品进行非定向筛查（实验流程见图1），实现了乳及乳制品中的农药残留的快速、高通量、非定向筛查。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 Avnti J-26×PI型高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）; Vortex.Genie2T型旋涡混合器（美国Scientific Industries公司）; SA31型振荡器（日本Yamata公司）; 超声波清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）; AL204-IC型分析天平、SevenEasy S20K型pH计（瑞士Mettler Toledo公司）; ED-115型恒温干燥箱（德国Binder公司）; UltiMate3000-Q-Exactiv超高效液相色谱-四极杆静电场轨道离子阱质谱、Accucore C-18 aQ色谱柱预柱、Hypersil Gold aQ C-18色谱柱（美国Thermo Fisher Scientific公司）; Milli-Q Integral型纯水仪（美国Millipore公司）。 NaCl（色谱纯，荷兰Akzo Nobel公司）; 0.20 μm微孔濾膜（美国Pall公司）; 石墨化炭黑GCB吸附剂（粒径40～120 μm）、C18和PSA吸附剂（粒径40～60 μm，平均孔径60 ）、陶瓷均质石（美国Agilent Technologies公司）; 无水乙酸钠、倍半水合柠檬酸二钠、二水合柠檬酸钠（优级纯，美国Supelco公司）; 甲苯、乙酸铵（色谱纯，美国Supelco公司）; 丙酮、乙腈（色谱纯，美国Fisher科技公司）; 甲醇、甲酸、乙酸、甲酸铵（色谱纯，美国Sigma公司）; 585种农药标准物质（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司、英国LGC Standards公司、瑞士Fluka公司、德国Sigma-Aldrich公司与德国Witega公司）。巴氏杀菌乳与超高温瞬时灭菌乳样品购自本地超市。 2.2?实验方法 2.2.1?溶液的配制?分别称取农药标准品10 mg（精确至0.1 mg），依据标准物质在不同溶剂（甲醇、乙腈和甲苯）中溶解度与测定需要，选用合适的溶剂溶解并定容至10 mL，配制成1000 μg/L的单一化合物标准储备液，于20℃避光保存。移取适量单一化合物标准储备液，用甲醇-水溶液（1∶1， V/V）稀释并定容至100 mL棕色容量瓶，配制相应浓度的标准物质混合工作溶液，于20℃避光保存。 基质匹配混合标准工作溶液用于标准校正曲线的绘制，乳及乳制品经2.2.2节样品前处理后获取空白样品提取液，移取5 mL空白样品提取液共12份，氮吹至近干，分别加入1000 μg/L 农药标准品混合溶液10～5000 μL、甲醇5 mL，用8 mmol/L甲酸铵溶液配制成1～500 μg/L的基质匹配标准溶液。 2.2.2?样品前处理?称取混匀乳制品样品10 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL 1%（V/V）乙酸-乙腈（8∶4∶16，V/V）混合溶液，涡旋混合30 s后， 加入陶瓷均质石、6.0 g无水MgSO4、1.45 g无水乙酸钠，涡旋30 s后，振荡提取1 min，在4 ℃以10000 r/min離心5 min，取200 μL滤液至2 mL进样小瓶中，加入500 μL 8 mmol/L甲酸铵溶液及300 μL甲醇，进行UHPLC-Q-Orbitrap MS测定。 2.3?色谱质谱条件 色谱柱： Accucore C-18 aQ预柱（10 mm×2.1 mm， 1.9 μm）， Hypersil Gold aQ C-18柱（100 mm×2.1 mm， ?1.9 μm）， 柱温： 35℃。流动相A为0.1%（V/V）甲酸-4 mmol/L甲酸铵溶液， 流动相B为0.1%（V/V）甲酸-4 mmol/L甲酸铵-甲醇溶液。梯度洗脱程序： 0～1 min， 100% A; 1～7 min， 100%～0% A; 7～12 min， ?0% A; 12～13 min， 0%～100% A; 13～15 min， 100% A。流速为300 μL/min， 进样量5 μL， 碰撞气为纯氩气（纯度≥99.999%）。电喷雾离子化（ESI）离子源， 采用正模式， 鞘气流速18 L/min， 鞘气压力275 kPa， 辅助气流速3 L/min; 毛细管电压： 3500 V。离子源温度350℃， 毛细管温度320℃。 全扫描模式下（Full Scan）， 分辨率设定为70000 FWHM， 自动增益控制的目标值（AGC）定为1.0×106， 容许的质量误差范围为5 ppm， 最大注入时间250 ms， 动态背景扣除（Dynamic Exclusion）设定为10.0 s。 第一种二级扫描方式Full MS/dd-MS2的分辨率设定为17500 FWHM， 自动增益控制的目标值定为5.0×105， 出峰后的触发时间（Apex Trigger）为3～6 s， 最大注入时间120 ms， 动态背景扣除为10.0 s， 选择TOP 5模式。待碎裂的目标分析物在特定的信息列表（Inclusion List）中设定， 容许质量误差范围设定为10 ppm。当待碎裂的离子响应强度达到强度阈值8.3×104时， 即送入高能碰撞解离（HCD）碰撞池， 通过3个不同的碰撞能量（17.5、35.0和52.5 eV）分别进行碰撞， 最终叠加得到一张子离子谱图。 第二种二级扫描方式为可变的数据非依赖采集（vDIA），参数设定为： 扫描时间0～15 min; 自动增益控制的目标值设定为5.0×105，最大注入时间为120 ms; 分辨率采用17500 FWHM; 信息列表分为： 112.80116、137.81253、162.82390、187.83527、212.84663、237.85800、262.86937、287.88074、312.89211、337.90348、362.91485、387.92622、412.93758、437.94895、462.96032、487.97169、550.50011、650.54559、750.59106、850.63654，其中112.80116～487.97169设定为第一个vDIA扫描，隔离窗口范围（Isolation window）设为25.0 Da，Loop Count设定为16（即16个扫描段），550.50011～850.63654设为第二个vDIA扫描，动态背景扣除10.0 s，隔离窗口范围设为100.0 Da，Loop Count设定为4。碰撞能量分别为17.5、35.0和52.5 eV。 3?结果与讨论 3.1?农药残留标准数据库建立 按照2.2.1节的操作，将标准溶液逐级稀释配制成浓度为100 μg/L标准溶液，用于标准数据库的采集，使得分子离子峰响应强度大于5.0×106。运用Full MS/dd-MS2扫描模式建立标准数据库，每个化合物平均进样6次，以确保数据的准确性与重现性，信息包括分子离子质荷比（理论值）、二级碎裂片段的质荷比与保留时间。电子版文后支持信息表S1列出了585种农药的标准数据库部分内容。数据库的信息数据使用Exact Finder 2.5进行管理。使用Mass Frontier 7.0软件，基于电离模式与结构式预测碎片断裂结果，并结合dd-MS2实测的二级断裂碎片的质谱图，选取1～3个响应值高且特征性的碎裂片段; 根据元素的组成将碎裂片段质荷比的实测值转换为理论值，形成化合物标准谱库（Library）; 使用Library Manager 2.0软件进行数据管理。电子版文后支持信息表S 2列出了585种农药的高效液相色谱/四极杆-轨道离子阱质谱参数。 3.2?片段断裂特征及其在农药残留筛查中的作用 3.2.1?农药质谱裂解反应机理?实验中对100种农药进行了片段断裂机理研究，得到了所有片段的质谱裂解反应途径。以有机氯类农药苄草隆（Cumyluron）为例进行分析，苄草隆dd-MS2扫描谱图如图2所示。苄草隆的分子离子质荷比（m/z）理论值为303.12587，经加氢后，在奇电子离子中有一个未成对电子，此电子在分子离子中处于反应的最有利位置，形成游离基中心，由图3可见，游离基中心定义于饱和N原子（亚氨基）上，未成对电子有趋于成对倾向，形成α断裂反应的推动力，诱导与亚氨基相邻的苄基外侧链断裂，形成m/z 185.04762与119.08553两个碎裂片段，m/z 185.04762碎裂片段进行γ位氢原子重排反应（rHC），在N游离中心诱导下，使γ氢原子重排到与N连接的位置，接着发生断裂形成m/z 73.03964碎裂片段。m/z 119.08553碎裂片段还有两种来源途径： 一种来源途径是电荷中心诱导断裂（i断裂），正电荷中心位于酰脲结构的O原子上，与酰脲结构相连苄基的键上一对电子被正电荷中心所吸引，造成电荷的转移和两侧苄基单键的断裂，形成m/z 119.08553与125.01525两个碎裂片段; 另一种来源途径为远端重排反应（rHR），苄基与酰脲结构相连的氢由于处在支化程度最高的碳原子上，极不稳定，在游离基诱导的氢重排反应中，该氢与苄基内部不成对电子位置发生互换，因此支化程度最高的碳原子上接受原处于苯环上的不成对电子，苄基与酰脲结构断裂[23]。 3.2.2?片段断裂特征?苄草隆的分子式为C17H19ClN2O， 属于有机氯农药，有机氯农药主要依据合成原料结构特征分为苯、环戊二烯、莰烯和萜烯四大类。因氯苯结构稳定，动物与植物体内不含有相应的降解酶，通过食物链产生生物富集作用，毒性显著，含氯苯结构的有机氯农药被广泛使用[24]。通過对氯苯结构的有机氯农药片段断裂机理研究发现，苄草隆、克死螨、3-氯对甲苯胺、绿麦隆、庚烯磷、多效唑与灭菌唑等氯苯结构农药均有C7H6Cl+碎片（m/z 125.01524）， 即功效作用（结构特性）与片段断裂特征一致。离子裂解的基本机理本质为电子转移规律，包括游离基中心诱导的键断裂、电荷中心诱导的键断裂、简单键断裂（σ断裂）和重排反应四大基本裂解反应类型，所以离子裂解的历程具有规律性[25]。因化合物断裂为分子离子，与高纯氮气碰撞，动能转化为热能，化学结合键断裂，故采用了高（52.5 eV）、中（35.0 eV）、低（17.5 eV）3个碰撞能，得到的二级谱图为3个碰撞能谱图的均一化结果，碎裂片段信息丰富，规律的碰撞诱导历程（特征断裂片段信息）在已建立的农药标准数据库中均得到全面体现。通过对片段断裂机理研究，并结合不同化合物的功效作用，表1列出了有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等100种农药的特征断裂片段。 根据结构特性，农药分为有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、三唑类、三嗪类、烟碱类与酰胺类。有机磷类农药的功能基团为磷酰基，磷酰基与乙酰胆碱酶活性位点紧密结合，形成磷酰化胆碱酯酶，乙酰胆碱酶活性被抑制，以致乙酰胆碱不能及时分解，在体内大量蓄积，突触后膜上受体不断与乙酰胆碱结合，造成突触后膜上Na+通道处于开放状态，Na+涌入膜内使胆碱能神经系统与中枢神经系统过度兴奋，最后导致衰竭[26]。磷酰基质谱碎片为C2H6O2PS+（m/z 124.98206）、C2H7NO2P+（m/z 108.02089）、H4O4P+（m/z 98.98417）、CH4OPS+（m/z 94.97150）。氨基甲酸酯类农药为氨基甲酸的N-甲基取代酯类，氨基甲酸的N-甲基取代酯类可将胆碱酯酶活性中心的羟基甲酰化，并形成疏松的复合体，抑制乙酰胆碱水解能力，造成组织内乙酰胆碱蓄积，引起迟发型神经疾病[27]。氨基甲酸N-甲基取代酯结构质谱碎片为C2H3NO+（m/z 55.02092）。拟除虫菊酯类农药的功能基团为除虫菊素结构，此结构可直接作用于神经膜的Na+通道，干扰Na+的传导，使跨膜离子流延长，造成运动神经轴与感觉神经纤维反复活动，最终运动失调[28]，除虫菊素结构质谱碎片为C9H15+（m/z 123.11683）。三唑类农药活性基团为三唑结构，三唑结构通过抑制生物体合成麦角甾醇，加剧细胞膜渗透，导致细胞膜功能被破坏[29]。三唑结构质谱碎片为C2H4N3+（m/z 70.03997）。三嗪类农药功能基团为三嗪结构，三嗪结构通过抑制生物几丁质合成，扰乱前胸腺体与心侧体等神经内分泌系统正常活动[30]，三嗪结构质谱碎片为C4H9N2+（m/z 85.06702）。烟碱类农药的活性基团为烟碱结构，烟碱结构可与烟碱型的乙酰胆碱结合，刺激神经系统，机体兴奋、痉挛、麻痹而死[31]，烟碱结构质谱碎片为C7H8N+（m/z 85.06702）。酰胺类农药的功能基团为酰胺结构，酰胺结构与钙离子通道中鱼尼丁受体结合，抑制Ca2+通道活性，导致生物体失去肌肉收缩舒张功能[32]，酰胺结构质谱碎片为C8H5NO+2（m/z 148.03930）。 3.2.3?特征断裂片段在外源性风险物质筛查中的应用?将农药特征断裂片段与农药残留标准数据库相结合应用于乳制品非定向农药筛查中。采用Full MS/vDIA扫描模式，运用表1中农药特征断裂片段对色谱图进行峰提取，若捕获到未出现在农药标准信息谱库且呈高斯分布的色谱峰， 即可初步判断该物质的农药归属类别，继而对该保留时间色谱峰的其它片段信息进行分析，包括m/z、碎裂片段丰度比与同位素丰度比，从而推断出该物质和元素组成，将该物质推断的片段断裂途径与已建立的该类农药标准信息谱库中归属类的其它化合物断裂途径比对，判断该化合物的分子式与结构式，通过分析标准物质的色谱质谱信息进行最终判定。化合物浓度由乳制品中农药化合物与化合物标准物质的峰面积比再乘以标准物质浓度计算而得。例如，在筛查一个牛乳样品时，运用有农药特征断裂片段m/z 125.01524提取出呈高斯分布且在标准信息库中没有的色谱峰，如图4所示，碎裂片段为氯苯结构，初步判断该物质为有机氯农药，通过m/z、同位素丰度比、片段丰度比信息推断该物质分子式为CxHyClzNS，将丰度较高的片段的碎裂途径与农药标准信息谱库的其它化合物断裂途径对比，发现该未知化合物与苄草隆的碎裂片段断裂机理相似（图5），通过对谱图与标准物质比对分析，判断该化合物为草克乐，且定量结果为6.1 μg/kg。 3.3?方法学参数考察 方法学参数考察根据欧盟标准2002/657/EC与SANCO/12571/2015。按以下公式计算检测方法的基质效应（C，%）： 其中，C（%）为基质效应; Ss为目标化合物运用纯溶剂制作标准曲线的斜率; Sm为目标化合物加入空白基质制作的基质匹配标准曲线的斜率。 结果表明，在585种农药中，大部分化合物存在基质效应，其中11.6%属于中等强度的基质效应（20%～50%），85.9%为较弱基质效应（±20%以内），其余的少数化合物属于强基质效应（50%～100%）。为尽量降低基质效应干扰，在建立校准曲线时，标准物质混合溶液采用基质匹配法进行配制。配制585种农药系列混合标准物质溶液，浓度为0.1～500 μg/kg。检测方法中外源性风险物质在各自相应的浓度范围内，相关系数（r2）均大于0.99，呈良好的线性关系。 在进行非定向筛查时，根据欧盟分析方法性能标准、定性定量检测技术细节《SANCO/12571/2015 Safety of the Food Chain Chemicals， Contaminants， Pesticides》与其他要求和步骤法案《2002/657/EC Implementing Councial Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Inpterpretation of Results》进行方法学参数考察，包括回收率、精密度、确定限（CCα）和检测容量（CCβ）与相对标准偏差。 使用CCα和CCβ考察方法检出限与定量下限，分别为0.001～539 μg/kg与0.001～899 μg/kg。通过回收率评价实验的准确性，精密度通过6次平行实验回收率结果的相对标准偏差计算而得，在基质中添加1倍、2倍和4倍CCβ， 制得3个水平农药残留的系列混合标准物质溶液，按照2.2.2节提取净化后，运用UHPLC-Q-Orbitrap MS检测。各农药残留的平均回收率为77%～113%，相对标准偏差为0.1%～8.3%，所建立的方法准确性和精密度良好。 3.4?实际样品分析 采用UHPLC-Q-Orbitrap MS筛查93个批次巴氏杀菌乳与超高温瞬时灭菌乳中农药残留，表2列出了阳性样品的筛查结果，研究结果表明，本方法可用于牛乳中外源性风险物质的快速筛查。 4?结 论 利用UHPLC-Q-Orbitrap MS，选择dd-MS2与vDIA两种二级扫描方式，分析农药残留特征断裂片段，建立农药残留标准数据库，并建立了完整的非定向筛查方法。方法学验证中，585种农药残留在线性范围内均具有好的线性关系，实现了未知化合物筛查分析方法体系的建立，并将本方法应用于巴氏杀菌乳与超高温瞬时灭菌乳中农药残留筛查。 References 1?Miller-Cushon E K， DeVries T J. 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