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麻黄碱对脑缺血大鼠运动功能恢复的影响及分子机制研究

范文

李倩

摘要：为研究麻黄碱对脑缺血大鼠运动功能恢复的影响及相关的分子机制，选取体重为220～250 g的56只雄性SD大鼠，并随机将其分为麻黄碱治疗组、自然恢复组和假手术组，应用Koizumi线栓法建立单侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。应用横木行走试验在术后1、2、3、4周对其运动功能改善情况进行评定，应用免疫组织化学方法对缺血周围区突触素（SYP）、生长相关蛋白（GAP-43）表达的变化进行检测。结果表明，在各时间点，假手术组大鼠运动功能无明显改变（P>0.05）;在术后1周，运动功能评分最低的为自然恢复组，但随着时间的推移，自然恢复组的运动功能不断改善;相对于自然恢复组而言，麻黄碱治疗组运动功能恢复速度明显更快，且在术后1、2、3周，麻黄碱治疗组均明显快于自然恢复组（P<0.05）;4周之后，3组之间无显著差异（P>0.05）。在1、2、3周时，免疫组化光密度定量测定结果显示麻黄碱治疗组GAP-43和SYP的表达水平均明显高于自然恢复组。说明麻黄碱可对脑缺血后动物的运动功能恢复速度进行加速，且麻黄碱的加速机制与促进脑内结构重建和神经重塑的分子表达有关。

关键词：麻黄碱;脑缺血;大鼠;运动功能;分子机制

中图分类号：R49? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2019）09-0005-02

麻黃一直被中医认为有着活血通络的功效。根据相关文献显示，在对脑缺血所致的中风后遗症进行治疗时，麻黄与其他中药配伍使用，对神经功能缺损症状有明显的改善。然而，对中枢神经系统康复的作用及机理方面，单味的麻黄却没有明确的定论，但相关人士普遍认为与麻黄的主要药用成分麻黄碱有关。基于此，本次研究选取了56只雄性SD大鼠，应用Koizumi线栓法建立单侧大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，以此来研究麻黄碱对脑缺血大鼠运动功能恢复的影响及相关的分子机制。

1? 材料与方法

1.1? 分组动物

选取体重为220～250 g的56只雄性SD大鼠，随机将其分为麻黄碱治疗组（24只）、自然恢复组（24只）和假手术组（8只）。术后1、2、3、4周为各组的4个时间点，且在各时间点取不同数量的大鼠（麻黄碱治疗组6只，自然恢复组6只和假手术组2只）进行各项目的检测。

1.2? 模型的制备

应用Koizumi线栓法建立单侧MCAO模型。首先麻醉大鼠，固定于手术台上时取仰卧位，颈前正中行纵行切口，对颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）、右侧颈总动脉（CCA）进行分离暴露，并结扎CCA近端和ECA根部，剥离迷走神经。由颈外动脉插入栓线，经颈内动脉到大脑前动脉，机械性阻断大脑中动脉发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。如果需要再灌注，只需拔出栓线结扎伤口，即可恢复大脑血供。本试验缺血2 h后取出栓线实现再灌注。假手术组步骤与手术组相同，只是不插入栓线。

1.3? 给药方法

大鼠手术后，麻黄碱治疗组大鼠使用麻黄碱腹腔注射（3 mg/kg体重），每3 d注射一次，其余两组给予同剂量的生理盐水进行注射。

1.4? 对运动功能进行评定

应用横木行走试验在术后1、2、3、4周对大鼠运动功能改善情况进行评定。横木放置于距地面70 mm的高度，直径25 mm，长1 200 mm。按照0～6分法来划分等级。6分：无脚滑现象，能到达终点;5分：少量脚滑现象，能到达终点;4分：在一半以上的路程中出现脚滑现象，能到达终点;3分：肢体在前进时不起作用，能到达终点;2分：在前进时掉下;1分：可以站在横木上，不能前进;0分：掉下。

1.5? 免疫组织化学检测

应用免疫组织化学方法对缺血周围区突触素（SYP）、生长相关蛋白（GAP-43）表达的变化进行检测。SYP及GAP-43均为Sigma公司产品。整个操作过程均严格按照产品说明书进行。

1.6? 统计学处理和图像分析

用积分光密度值反映SYP和GAP-43免疫反应产物的强度和面积。要得出积分光密度值，首先要求出各阳性区光密度的积分和（∑∫ OD）。被检各区在每例标本中均对3张切片进行检测，并取其均值。用x±s表示所得结果。

2? 结果与分析

2.1? 各试验组在不同时间的运动功能评分

由表1可见，假手术组大鼠运动功能在各时间点均无明显改变（P>0.05）;在术后1周，运动功能评分最低的为自然恢复组，但随着时间的推移，自然恢复组大鼠的运动功能不断改善;相对于自然恢复组，麻黄碱治疗组大鼠恢复速度明显更快，且在术后1、2、3周均明显快于自然恢复组（P<0.05）;4周之后，3组之间无显著差异（P>0.05）。

2.2? GAP-43免疫组化染色结果

神经毡位置为GAP-43免疫反应产物的主要存在区，其染色也随着免疫产物和免疫反应的增强而加深。

假手术组：少量着色位于神经毡位置，免疫产物在两半球对称分布。不同的时间点之间无显著差异（P>0.05）。

自然恢复组：在梗死中心区未见到GAP-43的表达。在1周时GAP-43在梗死周围区的免疫活性达到高峰，在2周时开始降低，4周之后与假手术组之间无明显差异（P>0.05）。

麻黄碱治疗组：与自然恢复组有相同的GAP-43表达变化趋势。相较于自然恢复组，在前3个时间点其表达水平均明显偏高（P<0.05）（表2）。

颗粒状沉积或棕黄色点状为SYP免疫反应产物，神经毡内为SYP免疫反应产物的分布位置。免疫反应强弱与突触类型、颗粒的大小有关。

假手术组：神经毡内免疫产物在两半球对称分布。不同的时间点之间无明显差异（P>0.05）。

自然恢复组：未在梗死中心区见到SYP表达。在1周时SYP在梗死周围区的免疫活性开始增高，在2周时达到高峰，在3周时则开始降低，4周之后，3组之间无显著差异（P>0.05）。

麻黄碱治疗组：与自然恢复组具有相同的SYP表达变化趋势，相较于自然恢复组，其在前3个时间点的表达水平均明显偏高（P<0.05）（表2）。

3? 讨论

麻黄具有利尿消肿、宣肺平喘、发汗散寒等功能，入肺、膀胱，性味辛苦温，是我国宝贵的药用植物。在对神经可塑性的影响方面，麻黄对神经可塑性的正性影响通过本研究得到证实。动物整体恢复状况可以通过对侧前肢感觉运动整合功能的改善情况反映出来[1]。对动物感觉运动整合功能恢复情况进行评价的方法就是横木行走试验。本次研究结果显示，在各时间点，假手术组运动功能无明显改变（P>0.05）;在术后1周，运动功能评分最低的为自然恢复组，但随着时间的推移，自然恢复组的运动功能不断改善;相较于自然恢复组，麻黄碱治疗组运动功能恢复速度明显更快，且在术后1、2、3周均明显快于自然恢复组（P<0.05）;3组的运动功能在术后4周时均无明显差异（P>0.05）。这说明麻黄碱有促进神经康复的作用。

轴突生长锥质膜面是GAP-43表达产物的主要位置，且GAP-43作为一种快速转运磷酸蛋白，与突触重建、轴突再生以及神经发育密切相关，该产物于20世纪80年代初被发现[2]。GAP-43在脑皮层中的表达水平在成年时较低，在损伤时则显著增强，突触重建、轴突芽生的状态也与其表达强度相一致。因此GAP-43的表达可以作为常用的脑缺血損伤后的神经生长及再生的量化指标。本次研究结果显示，GAP-43表达在脑梗死后明显增加，在缺血再灌注后1周时GAP-43在梗死周围区的免疫活性达到高峰，在2周时开始降低。麻黄碱治疗组与自然恢复组具有相同的GAP-43表达变化趋势，且麻黄碱治疗组的GAP-43表达水平在前3个时间点均明显高于自然恢复组（P<0.05）。

SYP是一种位于突触囊泡膜上的钙结合蛋白，其新生突触的形成可由突触数量的增加来提示。其主要作用在钙依赖性神经递质释放过程中，是蛋白酪氨酸激酶的底物[3]。本次研究中，SYP在梗死周围区的免疫活性在1周时开始增高，2周时达到高峰，3周时开始降低。麻黄碱治疗组与自然恢复组有相同的SYP表达变化趋势，且麻黄碱治疗组SYP表达水平在前3个时间点均明显高于自然恢复组（P<0.05）。

4? 小结

本次研究结果显示，SYP和GAP-43的表达强度在麻黄碱治疗组中明显增强，说明对于脑结构再塑而言，麻黄碱有着积极作用。麻黄碱可促进中枢神经系统内如5-羟色胺、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺等多种神经递质的释放。

本次研究结果显示，在各时间点，假手术组大鼠运动功能无明显改变（P>0.05）;在术后1周，运动功能评分最低的为自然恢复组，但随着时间的推移，自然恢复组的运动功能不断改善;相较于自然恢复组，麻黄碱治疗组运动功能恢复速度明显更快，且在术后1、2、3周均明显快于自然恢复组（P<0.05）;3组的运动功能在术后4周时均无明显差异（P>0.05）。在1、2、3周时，免疫组化光密度定量测定结果显示麻黄碱治疗组GAP-43和SYP的表达水平均明显高于自然恢复组。上述结论表明，麻黄碱可对脑缺血后动物的运动功能恢复速度进行加速，且麻黄碱的加速机制与促进脑内结构重建和神经重塑的分子表达有关。

参考文献：

[1] 王海英，亚白柳，王文淼，等.电针对脑缺血-再灌注损伤大鼠运动功能的改善作用及机制研究[J].济宁医学院学报，2018，41（5）：313-316，321.

[2] 胡? 艳，张香玉，鲁银山，等.成对关联刺激对脑缺血再灌注大鼠感觉运动功能和MAP-2、GAP-43表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志，2018，40（10）：733-739.

[3] 鄢云彪，华? 骏，兰新新，等.银杏内酯注射液对脑缺血再灌注大鼠运动认知功能的影响[J].中药药理与临床，2018，34（1）：66-69.

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